てんかんによって惹起される海馬神経細胞新生は、てんかん原生となるか

Dentate neurogenesis and neural maturation in animal models of epilepsy

研究課題番号：20591722

2010年度 研究成果報告書 PDF

代表者

    • 中島 円
    • NAKAJIMA, Madoka
    • 研究者番号：50317450
    • 順天堂大学・医学部・助教

研究課題基本情報

  • 研究期間

    2008年度〜2010年度

  • 研究分野

    脳神経外科学

  • 審査区分

    一般

  • 研究種目

    基盤研究(C)

  • 研究機関

    順天堂大学

  • 配分額

    • 2008年度：1690千円 (直接経費：1300千円, 間接経費：390千円)
    • 2009年度：1170千円 (直接経費：900千円, 間接経費：270千円)
    • 2010年度：1170千円 (直接経費：900千円, 間接経費：270千円)

研究分担者

    • 菅野 秀宣
    • 研究者番号：90265992
    • 順天堂大学・医学部・准教授
    • 西村 欣也
    • 研究者番号：80164581
    • 順天堂大学・医学部・先任准教授
    • 新井 一
    • 研究者番号：70167229
    • 順天堂大学・医学部・教授

研究概要

【研究目的】神経細胞新生は、虚血やてんかん発作などの刺激で誘発され、侵襲による神経細胞壊死やアポートシスなどの神経細胞の減少を補うと考えられている。しかしながら一方では、海馬のてんかん原性獲得に神経細胞新生が原因をなしているともいわれ、新生による神経細胞のターンオーバーの機構や意義については未だ不明な点が多い。我々は、ピロカルピンによるてんかん発作を誘発させた動物モデルを用いて、てんかんによって惹起される海馬新生神経細胞の経時的変化を免疫染色およびPatch-clamp法による電気生理学的に検討し、海馬神経細胞新生のてんかん原生獲得への関与について研究した。

【方法】C57/BLマウスをピロカルピン腹注によるてんかん発作誘発24時間後に、レトロウィルスによりgreen fluorescent protein(GFP)を海馬にinjectionし感染させ、てんかんによって誘発された新生細胞をGFPによりマーキングした。てんかん重積後7日(1週)、14日(2週)、28日(4週)に海馬をスライスし免疫染色を行い、正常神経細胞への成熟度(NeuNの染色性)、apoptosisの割合(ssDNAの染色性)について検討した。GFPでマーキングされた細胞に対し、Patch-clamp法により新生された神経細胞の発火パターンを直接記録し細胞興奮性を検討した。

【観察結果】てんかん発作により新生細胞はsubgranule zoneに数多く惹起されるが形態も小さく脆弱であり、惹起されるほとんどの未熟なGFP陽性細胞は成熟過程に入ることなく発作後1週～4週の期間内に消退した。早期に消失がみられるGFP陽性細胞の免疫染色結果はssDNAにnegative、NeuN negativeであった。また神経生理学的には、発作後1～2週のGFP陽性細胞はinput resistances (IR) 1.2GΩ～2.0GΩ、resting membrane potential (RMP)は-55mV～-70mV。発作後4週のGFP陽性細胞ではIR300MΩ～1000MΩ、RMP-70～-80mVであった。てんかんによって惹起された新生神経細胞は未熟な細胞であるほど膜抵抗性が高く、発火頻度が少なく、成熟度とともに徐々に発火頻度が多い傾向を示した。

【Purpose】Neuronal regeneration is thought to be induced by stimulation from ischemia or epileptic seizures, as well as to compensate for neuronal necrosis or apoptosis from such insults. It is also said that neuronal regeneration is a cause of hippocampal epileptogenesis, although much is unknown about the turnover mechanism or significance of newly formed neurons. Using an animal model in which epileptic seizures were induced by pilocarpine, changes in hippocampal neurogenesis with time brought about by epilepsy were investigated using immunostaining and electrophysiological (patch-clamp) techniques. The role of hippocampal neurogenesis in epileptogenesis was then examined.

【Methods】Forty-eight hours after epileptic seizures were induced by intraperitoneal injection of pilocarpine in C57/BL mice, the hippocampus was injected with a green fluorescent protein (GFP) using a retrovirus. Thus, new nerves induced by the epileptic seizure were marked with GFP. Immunostaining was done 7 days (1 week), 14 days (2 weeks), and 28 days (4 weeks), 6 months after status epilepticus, and the degree of maturation of normal neurons (NeuN staining), DCX, NeuroD, PSA, BrdU and the proportion of apoptosis (ssDNA staining) were investigated. With the patch-clamp, the firing pattern in the cells marked with GFP was directly recorded to investigate cell excitability.

【Observation results】Many new cells were produced in the subgranule zone after the epileptic seizures, but they were small and fragile, and almost none of the immature GFP-positive cells entered the maturation process. They disappeared by 1-4 weeks after the seizure. The GFP-positive cells that disappeared at an early stage were negative for both ssDNA and NeuN. The GFP-positive cells at 1-2 weeks after the seizure had input resistances (IRs) of 1.2 GΩ-2.0 GΩ and resting membrane potentials (RMPs) of -55 mV to -70 mV. The GFP-positive cells at 4 weeks had IRs of 300 MΩ-1000 MΩ and RMPs of -70 mV to -80 mV. The membrane resistance in the new neurons induced by epilepsy was higher in the less mature cells, and they had a low firing rate.

発表文献

雑誌論文

  • 菅野秀宣、中島円,荻野郁子,新井一: "ヒト側頭葉てんかんにおける海馬神経細胞新生" てんかん研究 26. 16-25 (2008)

  • 中島円、菅野秀宣,荻野郁子,新井一: "GFPの遺伝子導入による海馬神経細胞の新生とてんかん原生との関連" 順天堂医学 54巻4号. (2008)

  • Hidenori Sugano, Hajime Nakanishi, Madoka Nakajima, Kyoko Tanaka, Kazuaki Shimoji, Konstandin Karagiozov, Hajime Arai: "Seizures continue even after prompt anti-epileptic drug medication in Sturge-Weber syndrome-study from prolonged video electrocorticography, a case report." Childs Nerv Syst 25. 143-146 (2009)

  • 中島円,菅野秀宣: "てんかんによって惹起される海馬新生神経細胞の電気生理学的検討Dentate neurogenesis and neural maturation in animal models of epilepsy." 順天堂医学 56巻6号. 498

  • 菅野秀宣、中島円: "Sturge-Weber syndrome No Shinkei Geka." Neurological surgery. 38(7). 613-20 (2010)

学会発表

  • 中島円,菅野秀宣,荻野郁子,新井一: "ヒト側頭葉てんかん患者海馬で生じている神経細胞新生の検討" 第31回日本てんかんの外科学会. (20080124-20080125). 浜松

  • 中島円,菅野秀宣,荻野郁子,新井一: "ヒト側頭葉てんかんにおける海馬神経細胞新生と成熟" 第42回日本てんかん学会. (20081018-20081019). 東京

  • Madoka Nakajima, Hidenori Sugano, Ikuko Ogino, Madoka Nakajima, Hidenori Sugano: "Neurogenesis and neural maturation in human epileptic hippocampus." American Epilepsy Society 2008 Annual Meeting. (20081205-20081209). Seattle

  • 中島円: "Reorganization by Neurogenesis is Restricted in the Sclerotic Hippocampus-An Immunohistochemical Analysis of Human Epileptic Hippocampus" Asian Australasian Society of Stereotactic and Functional Neurosurgery. (20090108-20090110). Hong Kong

  • 中島円,菅野秀宣,大倉英浩,新井一: "頭蓋内硬膜下電極留置術における開頭の工夫" 第32回日本てんかんの外科学会. (20090122-20090123). 東京

  • 中島円,菅野秀宣,大倉英浩,新井一: "てんかんによって惹起される海馬神経細胞新生の電気生理学的検討" 第43回日本てんかん学会. (20091022-20091023). 東京

  • 中島円,菅野秀宣,新井一: "発作残存てんかん手術例に対する新規抗てんかん薬の効果Effects of new antiepileptic agents, topiramate and lamotrigine, in patients with residual epilepsy following epilepsy surgery." 第44回日本てんかん学会. (20101000). 岡山

  • 中島円, 菅野秀宣, 新井一: "Electrophysiological investigation of hippocampal neurogenesis induced by epilepsy." American Epilepsy Society. (20101200). San Antonio

その他・備考

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