酸性域で触媒活性をもつ新奇セリンエンドペプチダーゼの構造と機能の特徴

• Project/Area Number: 08780563
• Research Category: Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
• Allocation Type: Single-year Grants
• Research Field: Structural biochemistry
• Research Institution: Kagoshima University
• Principal Investigator: 内木場 哲也 鹿児島大学, 理学部, 助手 (20203531)
• Project Period (FY): 1996
• Project Status: Completed (Fiscal Year 1996)
• Budget Amount: ¥1,000,000 (Direct Cost: ¥1,000,000); Fiscal Year 1996: ¥1,000,000 (Direct Cost: ¥1,000,000)
• Keywords: セリンプロテアーゼ / Ipomoea batatas / タンパク質分解 / 酵素反応機構 / 酵素触媒部位 / エンドペプチダーゼ / 植物プロテアーゼ

Research Abstract

酸性pH領域で触媒活性を有するセリンエンドペプチダーゼについてはその触媒機構を探る上で興味深い対象である。本年度、著者はIpomoea batatas塊根より微量含まれるそのタイプのセリンエンドペプチダーゼを、塊根抽出液の硫安沈殿透析液よりDEAE-cellulose→Con A-Sepharose→Butyl-Toyopearl 650M→Hydorxyl-apatite HPLCによる精製手順により初めて単離することに成功した。酸性域でDFPにより阻害される酵素は少なくとも2種類(A,B)あり、両者はButyl-Toyopearl 650Mで分離できた。今回は酵素Aについて研究をおこなった。本酵素はSDS-PAGE上で単一バンド(分子量6万7千、銀染色による)を示した。精製酵素のSDS-PAGEゲ-ル上での活性染色では67kDa付近にゼラチン分解活性がみられた。プロテインシーケンサーでN末端一次構造解析を行ったところ、N末端は何らかの修飾のためにブロックされている可能性が高いことがわかった。現在BrCN分解法による断片化で内部配列の解析し、cDNA解析用オリゴヌクレオチドプローブを作成し、mRNAからの構造の推定作業を進めている。代表的な植物由来セリンエンドペプチダーゼcucumisinを抗原とする抗体と本酵素との間でウエスタンブロットを行ったところ反応がみられず、さらに各種プロテアーゼインヒビターによる酵素活性への影響を調べたが、従来の動植物由来プロテアーゼと類似した阻害傾向は見いだせないことからcucumisionとは異なるタイプの植物セリンエンドペプチダーゼである可能性が高い。活性残基周辺配列の同定を活性部位指向性試薬であるBiotion-Ala-Ala-Pro-Phe-CKを使用した新手法により進め、本酵素がこの化合物により酵素活性が抑えられることが判明し、本酵素の触媒活性にHis残基が関与することを示唆している。