| 研究課題/領域番号 |
12019265
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| 研究種目 |
特定領域研究(A)
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| 配分区分 | 補助金 |
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| 研究機関 | 早稲田大学 |
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研究代表者 |
木野 邦器 早稲田大学, 理工学部, 教授 (60318764)
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| 研究分担者 |
宇佐美 昭次 早稲田大学, 理工学部, 教授 (50063508)
桐村 光太郎 早稲田大学, 理工学部, 教授 (90195412)
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| 研究期間 (年度) |
2000
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| 研究課題ステータス |
完了 (2000年度)
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| 配分額 *注記 |
1,800千円 (直接経費: 1,800千円)
2000年度: 1,800千円 (直接経費: 1,800千円)
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| キーワード | 制限修飾系酵素 / 遺伝子クローニング / 部位特異的変異 / タンパク質工学 / 進化分子工学 |
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| 研究概要 |
酵素タンパク質に対する新規改変手法の方法論の構築を目的に、制限酵素BamHIの耐熱性向上をモデルとして研究を実施。
Bacillus amyloliquefaciensH株の染色体DNAを抽出し、制限酵素BamHI遺伝子(bamHIR)と対応する修飾酵素遺伝子(bamHIM)を含むDNA断片を取得したが、大腸菌において一段階でクローニングすることは不可能であった。そこでbamHIMとbamHIRの個別クローニングを検討した。PCRによりbamHIMを含む約1.8kbHindIIIのDNA断片を取得し、これをpUC19に連結してプラスミドpUBMCを構築した。次に本プラスミドをE.coliDH5αMCR株に導入して得られた形質転換株を宿主としてbamHIRのクローニングを行った。PCRにより得たbamHIRを含む約1.4kbHindIIIのDNA断片を低コピーベクターpSTV28に連結し、プラスミドpSBRCを構築した。このpUBMCとpSBRCの2種のプラスミドを保有するE.coliBRの菌体内抽出液には制限酵素BamHI活性が検出され、目的遺伝子のクローニングと大腸菌での発現に成功した。しかし、粗酵素の見かけ上の熱安定性はクローンごとにまちまちであり、また希釈して活性を測定したところ限界希釈濃度に差が認められたため、クローンごとに発現強度の異なることが示唆された。以上より、変異を導入した制限酵素BamHIの解析や正確な評価、ならびにその生産を考慮すると精製ステップを新たに組み入れる必要性のあることが明らかになった。
部位特異的変異の導入個所は、報告されている野生型BamHIの三次構造から算出した溶媒露出表面積やB-factor値よりアミノ酸の立体構造上の位置と揺らぎを計算し、二次構造・活性中心を加味して8ヶ所決定した。さらにその候補部位に対して、一般的にタンパク質を安定化すると考えられているアミノ酸の置換をシミュレーションして有効な置換アミノ酸を決定した。
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