迅速に進行するリン酸基転移反応の中間体ダイナミクスを可視化する分析技術の創出

• 研究課題/領域番号: 15K07887
• 研究種目: 基盤研究(C)
• 配分区分: 基金
• 応募区分: 一般
• 研究分野: 物理系薬学
• 研究機関: 広島大学
• 研究代表者: 木下 恵美子 広島大学, 医歯薬保健学研究科(薬), 助教 (40379912)
• 研究期間 (年度): 2015-04-01 – 2018-03-31
• 研究課題ステータス: 完了 (2017年度)
• 配分額: 4,810千円 (直接経費: 3,700千円、間接経費: 1,110千円); 2017年度: 1,560千円 (直接経費: 1,200千円、間接経費: 360千円); 2016年度: 1,820千円 (直接経費: 1,400千円、間接経費: 420千円); 2015年度: 1,430千円 (直接経費: 1,100千円、間接経費: 330千円)
• キーワード: phos-tag / チオリン酸化タンパク質 / ATPgammaS / リン酸化タンパク質 / Phos-tag / リン酸基 / チオリン酸基 / ATPgS / リン酸基転移反応 / 反応中間体 / Phos-tag SDS-PAGE / ATPγS

研究成果の概要

生体内にはヒスチジンやアスパラギン酸のリン酸化を介した情報伝達機構がある。それらのアミノ酸のリン酸化型は化学的に不安定で加水分解されやすくリン酸基転移反応のダイナミクスを捉えることが困難だった。ATPアナログのATPgammaSを用いたin vitro反応では，チオリン酸化ヒスチジンやチオリン酸化型アスパラギン酸が生成し，それらは加水分解を受けにくい。リン酸基親和性電気泳動法のPhos-tag SDS-PAGEを用いて，チオリン酸化型タンパク質を分離し，これまで解析できなかった不安定化学種を持つリン酸基転移反応のダナミクスを解析した。

研究成果

• [雑誌論文] Specific glutamic acid residues in targeted proteins induce exaggerated retardations in Phos-tag SDS-PAGE migration (2017)
  • 著者名/発表者名: E.Kinoshita, E. Kinoshita-Kikuta, K. Karata, T. Kawano, A. Nishiyama, M. Yamato, and T. Koike
  • 雑誌名: Electrophoresis 巻: 38 号: 8 ページ: 1139-1146
  • DOI: 10.1002/elps.201600520
  • 査読あり / オープンアクセス / 謝辞記載あり
• [雑誌論文] TAMRA/TAMRA fluorescence quenching systems for the activity assay of alkaline phosphatase (2017)
  • 著者名/発表者名: A. Shiba, E. Kinoshita-Kikuta, E. Kinoshita, and Tohru Koike
  • 雑誌名: Sensors 巻: 17 号: 8 ページ: 1877-1888
  • DOI: 10.3390/s17081877
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] Zn(II)-Phos-tag SDS-PAGE for Separation and Detection of a DNA Damage-Related Signaling Large Phosphoprotein (2017)
  • 著者名/発表者名: Kinoshita E., Kinoshita-Kikuta E., Koike T.
  • 雑誌名: Methods and Protocols, Methods in Molecular Biology 巻: 1599 ページ: 113-126
  • DOI: 10.1007/978-1-4939-6955-5_9
  • ISBN: 9781493969531, 9781493969555
• [雑誌論文] A novel thiol-affinity micropipette tip method using zinc(II)-cyclen-attached agarose beads for enrichment of cysteine-containing molecules. (2016)
  • 著者名/発表者名: Kusamoto, H., Shiba, A., Koretake, N., Fujioka, H., Hieda, Y., Kinoshita-Kikuta, E., Kinoshita, E., Koike, T.
  • 雑誌名: J. Chromatogr. B. Analyt. Technol. Biomed. Life. Sci. 巻: 1031 ページ: 195-201
  • DOI: 10.1016/j.jchromb.2016.07.049
  • 査読あり / オープンアクセス / 謝辞記載あり
• [雑誌論文] A Phos-tag SDS-PAGE method that effectively uses phosphoproteomic data for profiling the phosphorylation dynamics of MEK1. (2016)
  • 著者名/発表者名: Kinoshita E, Kinoshita-Kikuta E, Kubota Y, Takekawa M and Koike T.
  • 雑誌名: Proteomics 巻: 16 号: 13 ページ: 1825-1836
  • DOI: 10.1002/pmic.201500494
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] Phosphopeptide detection with biotin-labeled Phos-tag. (2016)
  • 著者名/発表者名: Kinoshita-Kikuta, E., Kinoshita, E., and Koike, T.
  • 雑誌名: Methods and Protocols, Methods in Molecular Biology 巻: 1355 ページ: 17-29
  • DOI: 10.1007/978-1-4939-3049-4_2
  • ISBN: 9781493930487, 9781493930494
  • 査読あり / オープンアクセス / 謝辞記載あり
• [雑誌論文] Validation of cis and trans modes in multistep phosphotransfer signaling of bacterial tripartite sensor kinases by using Phos- tag SDS- PAGE. (2016)
  • 著者名/発表者名: Kinoshita- Kikuta, E., Eiji Kinoshita, Eguchi, Y., Koike, T.
  • 雑誌名: PLoS One 巻: 11 号: 2 ページ: e0148294-e0148294
  • DOI: 10.1371/journal.pone.0148294
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] Expression and phosphorylation state analysis of intracellular protein kinases using Multi- PK antibody and Phos- tag SDS- PAGE. (2015)
  • 著者名/発表者名: Sugiyama, Y., Katayama, S., Kameshita, I., Morisawa, K., Higuchi, T., Todaka, H., Eiji Kinoshita, Kinoshita- Kikuta, E., Koike, T., Taniguchi, T., Sakamoto, S.
  • 雑誌名: MethodsX 巻: 2 ページ: 469-474
  • DOI: 10.1016/j.mex.2015.11.007
  • 査読あり / オープンアクセス / 国際共著
• [雑誌論文] The cutting edge of affinity electrophoresis technology (2015)
  • 著者名/発表者名: Eiji Kinoshita, Kinoshita-Kikuta, E., and Koike, T.
  • 雑誌名: Proteomes 巻: 3 号: 1 ページ: 42-55
  • DOI: 10.3390/proteomes3010042
  • 査読あり / オープンアクセス / 謝辞記載あり
• [雑誌論文] Advances in Phos- tag- based methodologies for separation and detection of the phosphoproteome. (2015)
  • 著者名/発表者名: Eiji Kinoshita, Kinoshita- Kikuta, E., and Koike, T.
  • 雑誌名: Biochim. Biophys. Acta 巻: 1854 号: 6 ページ: 601-618
  • DOI: 10.1016/j.bbapap.2014.10.004
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] Phos-tag SDS-PAGEゲルからの標的リン酸化タンパク質の転写効率改善 (2015)
  • 著者名/発表者名: 木下英司，木下恵美子，小池透
  • 雑誌名: 分析化学 巻: 64 ページ: 501-509
  • NAID: 130005091793
  • 査読あり / オープンアクセス
• [学会発表] Phos-tag SDS-PAGEを用いたN-ミリストイル化依存的なタンパク質リン酸化反応の解析 (2018)
  • 著者名/発表者名: 谷川 綾音，木下 恵美子，黄波戸 亜哉，守屋 康子，木下 英司，小池 透，内海 俊彦
  • 学会等名: 日本農芸化学会大会
• [学会発表] 亜鉛酵素モデルに対するリガンドの親和性を解析する新規分光分析法の開発 (2018)
  • 著者名/発表者名: 草本 寛，芝 晃生，常弘 昌弥，藤岡 晴人，木下 恵美子，木下 英司，小池 透
  • 学会等名: 日本薬学会第138年会
• [学会発表] 蛍光クエンチングを用いるアルカリホスファターゼ分析の新規蛍光分析法の開発 (2018)
  • 著者名/発表者名: 芝 晃生，木下 恵美子，木下 英司，小池 透
  • 学会等名: 日本薬学会第138年会 金沢
• [学会発表] フォスタグ技術とプロテオミクス情報を活用した細胞内MEK1リン酸化ダイナミクスのプロファイリング (2017)
  • 著者名/発表者名: 木下英司，木下恵美子，小池透
  • 学会等名: 第137回日本薬学会年会
  • 発表場所: 仙台市
  • 年月日: 2017-03-24
• [学会発表] タンパク質のリン酸化分子種全体を見える化するPhos-tag SDS-PAGE (2017)
  • 著者名/発表者名: 木下恵美子
  • 学会等名: 日本プロテオーム学会2017年大会
• [学会発表] プロテインキナーゼのリン酸化動態のプロファイリング法の開発 (2017)
  • 著者名/発表者名: 上里裕樹，木下英司，木下恵美子，小池透，亀下勇，杉山康憲
  • 学会等名: 2017年度生命科学系学会合同年会 ComBio2017
• [学会発表] Phos-tag SDS-PAGEを基盤としたin vitro キナーゼアッセイ法： 宿主細胞に由来する偽陽性のキナーゼ活性を見極める (2017)
  • 著者名/発表者名: 藤田萌々子，木下恵美子，木下英司，小池透
  • 学会等名: 第６８回日本電気泳動学会
• [学会発表] ハイブリッドヒスチジンキナーゼにおけるリン酸基転移反応様式の検証 (2017)
  • 著者名/発表者名: 池上まどか，木下恵美子，木下英司，小池透
  • 学会等名: 第６８回日本電気泳動学会
• [学会発表] 細胞内情報伝達におけるMEK1リン酸化種の動態解析 (2017)
  • 著者名/発表者名: 谷口翼，上田爽夏，石山美帆，木下恵美子，木下英司，小池透
  • 学会等名: 第６８回日本電気泳動学会
• [学会発表] Phos-tag SDS-PAGEの移動度に影響を及ぼすリン酸基以外の要因 (2017)
  • 著者名/発表者名: 木下恵美子，山戸護久，西山敦洋，河野敏己，木下英司，小池透
  • 学会等名: 第６８回日本電気泳動学会
• [学会発表] マルチPK抗体とPhos-tag 2D-PAGEを組み合わせたプロテインキナーゼのプロファイル法 (2017)
  • 著者名/発表者名: 上里裕樹, 木下英司, 木下恵美子, 小池透,亀下勇, 杉山康憲
  • 学会等名: 第６８回日本電気泳動学会
• [学会発表] Phos-tagを基盤としたin vitro キナーゼアッセイ法：宿主細胞に由来する偽陽性のキナーゼ活性を見極める有効手段 (2017)
  • 著者名/発表者名: 木下英司，木下恵美子，小池 透
  • 学会等名: 2017年度生命科学系学会合同年会 ComBio2017
• [学会発表] フォスタグ技術とプロテオミクス情報を活用した細胞内MEK1リン酸化ダイナミクスのプロファイリング (2016)
  • 著者名/発表者名: 木下英司，木下恵美子，久保田裕二，武川睦寛，小池透
  • 学会等名: 第39回日本分子生物学会年会
  • 発表場所: 横浜市
  • 年月日: 2016-11-30
• [学会発表] フォスタグ技術によるセンサーキナーゼの自己リン酸化制御機構の解析 (2016)
  • 著者名/発表者名: 木下恵美子
  • 学会等名: 第89回日本生化学大会
  • 発表場所: 仙台市
  • 年月日: 2016-09-25
• [学会発表] 大腸菌ハイブリッドセンサーキナーゼにおけるリン酸基転移反応様式の検証 (2016)
  • 著者名/発表者名: 木下英司，木下恵美子，江口陽子，小池透
  • 学会等名: 第89回日本生化学大会
  • 発表場所: 仙台市
  • 年月日: 2016-09-25
• [学会発表] Phos-tag SDS-PAGE methodology that effectively uses phosphoproteomic data for profiling the phosphorylation dynamics of MEK1 (2016)
  • 著者名/発表者名: Eiji Kinoshita, Emiko Kinoshita-Kikuta, and Tohru Koike
  • 学会等名: 15th Human Proteome Organization World Congress
  • 発表場所: 台北市（台湾）
  • 年月日: 2016-09-18
  • 国際学会
• [学会発表] Phosphate-affinity chromatographic micro-tip technology for enrichment of phosphopeptides towards phosphoproteomic study, (2016)
  • 著者名/発表者名: Maho Kawaguchi, Elena Tianfei Yuan, Yoko Ino, Yayoi Kimura, Hisashi Hirano, Emiko Kinoshita-Kikuta, Eiji Kinoshita, and Tohru Koike,
  • 学会等名: 15th Human Proteome Organization World Congress
  • 発表場所: 台北市（台湾）
  • 年月日: 2016-09-18
  • 国際学会
• [学会発表] Thio-tag tip method by using zinc(II)-cyclen-attached agarose beads for enrichment of cysteine-containing biomolecules (2016)
  • 著者名/発表者名: Hiroshi Kusamoto, Akio Shiba, Norinao Koretake, Emiko Kinoshita-Kikuta, Eiji Kinoshita, Tohru Koike
  • 学会等名: 15th Human Proteome Organization World Congress
  • 発表場所: 台北市（台湾）
  • 年月日: 2016-09-18
  • 国際学会
• [学会発表] チオール含有生体分子を分離・濃縮するためのThio-tag磁気ビーズの開発 (2016)
  • 著者名/発表者名: 河口真歩，藤岡晴人，木下恵美子，木下英司，小池透
  • 学会等名: 第67回日本電気泳動学会総会
  • 発表場所: 釧路市
  • 年月日: 2016-08-26
• [学会発表] Thio-tag Tipを用いたチオール基含有化合物の選択的分離精製法 (2016)
  • 著者名/発表者名: 草本寛，藤岡晴人，芝晃生，是竹紀尚，木下恵美子，木下英司，小池透
  • 学会等名: 第67回日本電気泳動学会総会
  • 発表場所: 釧路市
  • 年月日: 2016-08-26
• [学会発表] フォスタグ技術を用いたヒスチジンキナーゼにおける自己リン酸化ダイナミクスのプロファイリング (2016)
  • 著者名/発表者名: 木下英司，木下恵美子，小池透
  • 学会等名: 日本プロテオーム学会2016年大会
  • 発表場所: 北里大学（東京都港区）
  • 年月日: 2016-07-28
• [学会発表] Thio-tag Tipを用いたチオール基含有化合物の選択的分離精製法 (2016)
  • 著者名/発表者名: 草本 寛，芝 晃生，是竹 紀尚，木下恵美子，木下英司，小池透
  • 学会等名: 日本プロテオーム学会2016年大会
  • 発表場所: 北里大学（東京都港区）
  • 年月日: 2016-07-28
• [学会発表] ハイブリッドセンサーキナーゼにおけるリン酸基転移反応の制御機構 ～レシーバードメインによるリン 酸化レベルの負の制御機能～ (2016)
  • 著者名/発表者名: 木下英司，木下恵美子，小池透
  • 学会等名: 日本薬学会第136年会
  • 発表場所: 横浜市
  • 年月日: 2016-03-26
• [学会発表] Phos- tag SDS- PAGEを用いたリン酸化阻害物質の探索 (2016)
  • 著者名/発表者名: 曽根雄太郎，山野喜，志賀もえみ，杉本幸子，木下英司，木下恵美子，小池 透，大塚英昭，松浪勝義
  • 学会等名: 日本薬学会第136年会
  • 発表場所: 横浜市
  • 年月日: 2016-03-26
• [学会発表] Thio- tag Tipを用いたチオール基含有化合物の選択的分離精製法 (2016)
  • 著者名/発表者名: 草本寛，藤岡晴人，是竹紀尚，木下恵美子，木下英司，小池透
  • 学会等名: 日本薬学会第136年会
  • 発表場所: 横浜市
  • 年月日: 2016-03-26
• [学会発表] Developmento of Tio-tag magnetic, bead for rapid and selective separation of thiol-containing biomolecules. (2015)
  • 著者名/発表者名: Maho Kawaguchi, Norinao Koretake, Emiko Kinoshita- Kikuta, Eiji Kinoshita, and Tohru Koike
  • 学会等名: Pacifichem2015（国際学会）
  • 発表場所: ホノルル市(USA)
  • 年月日: 2015-12-15
• [学会発表] ハイブリッドセンサーキナーゼのリン酸機リレー情報伝達機構におけるレシーバードメインの制御機構 (2015)
  • 著者名/発表者名: 木下恵美子，木下英司, 江口陽，吉多美祐，山本兼由，内海龍太郎，小池透
  • 学会等名: BMB2015
  • 発表場所: 神戸市
  • 年月日: 2015-12-01
• [学会発表] Phos- tag SDS- PAGEゲルからの標的リン酸化タンパク質の転写効率の改善 (2015)
  • 著者名/発表者名: 木下英司、草本寛、木下恵美子、小池透
  • 学会等名: 日本電気泳動学会第66回総会
  • 発表場所: 東京
  • 年月日: 2015-09-04
• [学会発表] リン酸基捕捉能を持つダーククエンチャーを用いた蛍光分析法 (2015)
  • 著者名/発表者名: 國貞夏実、木下恵美子、木下英司、小池透
  • 学会等名: 日本電気泳動学会第66回総会
  • 発表場所: 東京
  • 年月日: 2015-09-04
• [学会発表] 迅速かつ簡便にリン酸化生体分子を分離精製するためのPhos-tag Tipの開発 (2015)
  • 著者名/発表者名: 河口真歩、井野洋子、木村弥生、平野久、木下恵美子、木下英司、小池透
  • 学会等名: 日本電気泳動学会第66回総会
  • 発表場所: 東京
  • 年月日: 2015-09-04
• [学会発表] Phos-tagビーズを用いたゲル内消化産物からのリン酸化ペプチド濃縮 (2015)
  • 著者名/発表者名: 井野洋子、木下英司、木下恵美子、小池透，戸田年総，平野久，木村弥生
  • 学会等名: 日本電気泳動学会第66回総会
  • 発表場所: 東京
  • 年月日: 2015-09-04
• [学会発表] Phos-tag tip, a novel tool for phosphoproteome study (2015)
  • 著者名/発表者名: EIji Kinoshita, Emiko Kinoshita-Kikuta, Yoko Ino, Yayoi Kimura, Hisashi Hirano, Thoru Koike
  • 学会等名: 日本プロテオーム学会2015年大会
  • 発表場所: 熊本市
  • 年月日: 2015-07-23
• [図書] Phosphopeptide detection with biotin- labeled Phos- tag, in Phospho- proteomics: Methods and Protocols, Methods in Molecular Biology, 1355 (2016)
  • 著者名/発表者名: Kinoshita- Kikuta, E., Eiji Kinoshita, and Koike, T.
  • 総ページ数: 13
  • 出版者: Springer
• [図書] Neutral phosphate affinity SDS- PAGE system for profiling of protein phosphorylation, in Proteomic Profiling: Methods and Protocols,Methods in Molecular Biology, 1295 (2015)
  • 著者名/発表者名: Kinoshita- Kikuta, E., Eiji Kinoshita, and Koike, T.
  • 総ページ数: 32
  • 出版者: Springer
• [図書] Phis-Tag based affinity chromatography techniques for enrichment of the phosphoproteome, in Protein Modifications in Pathogenic Dysregulation of Signaling. (2015)
  • 著者名/発表者名: Eiji Kinoshita,Kinoshita- Kikuta, E.,and Koike, T.
  • 総ページ数: 14
  • 出版者: Springer
• [図書] Phos- tag technology for kinomics, in Kinomics: Approaches and Applications. (2015)
  • 著者名/発表者名: Kinoshita- Kikuta, E., Eiji Kinoshita, and Koike, T.
  • 総ページ数: 16
  • 出版者: Wiley- VCH
• [備考] Phos-tag.com
  • URL: http://www.phos-tag.com