Live imaging of cell-to-cell communication

• Project Area: Resonance Biology for Innovative Bioimaging
• Project/Area Number: 15H05949
• Research Category: Grant-in-Aid for Scientific Research on Innovative Areas (Research in a proposed research area)
• Allocation Type: Single-year Grants
• Review Section: Biological Sciences
• Research Institution: Kyoto University
• Principal Investigator: 松田 道行 京都大学, 生命科学研究科, 教授 (10199812)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 隅山 健太 国立研究開発法人理化学研究所, 生命機能科学研究センター, ユニットリーダー (00370114) ; 平島 剛志 京都大学, 医学研究科, 講師 (10620198) ; 築地 真也 名古屋工業大学, 工学(系)研究科(研究院), 教授 (40359659) ; 平塚 拓也 京都大学, 医学研究科, 特定講師 (90641639)
• Project Period (FY): 2015-06-29 – 2020-03-31
• Project Status: Granted (Fiscal Year 2019)
• Budget Amount: ¥194,090,000 (Direct Cost: ¥149,300,000、Indirect Cost: ¥44,790,000); Fiscal Year 2019: ¥37,050,000 (Direct Cost: ¥28,500,000、Indirect Cost: ¥8,550,000); Fiscal Year 2018: ¥37,180,000 (Direct Cost: ¥28,600,000、Indirect Cost: ¥8,580,000); Fiscal Year 2017: ¥37,180,000 (Direct Cost: ¥28,600,000、Indirect Cost: ¥8,580,000); Fiscal Year 2016: ¥37,180,000 (Direct Cost: ¥28,600,000、Indirect Cost: ¥8,580,000); Fiscal Year 2015: ¥45,500,000 (Direct Cost: ¥35,000,000、Indirect Cost: ¥10,500,000)
• Keywords: バイオセンサー / 上皮細胞増殖因子 / FRET / 筋再生 / イメージング / 細胞生物学 / 再生 / 蛍光バイオセンサー / FRETバイオセンサー / 蛍光タンパク質 / 分子プローブ / 蛍光共鳴エネルギー移動 / タンパク質リン酸化酵素

Outline of Annual Research Achievements

FRETバイオセンサーを発現する培養細胞やトランスジェニックマウスを蛍光顕微鏡あるいは多光子顕微鏡で観察することで、細胞間コミュニケーションを可視化し、そのメカニズムを解析した。
1.RhoファミリーGタンパク質により活性化されるセリンスレオニンリン酸化酵素ROCKの活性を測定するFRETバイオセンサーを作成した。ROCK阻害剤で低下し、Rhoを活性化することで確かにFRET効率が変化することを確認できたので、トランスジェニックマウスの作成を開始した。
2.ERKマップキナーゼのFRETバイオセンサーを発現する培養細胞を用いて癌遺伝子の恒常的発現がどのようにERKを制御しているかを解析した。その結果、RasやRafといったERKの上流因子の恒常的活性化においても、細胞密度が高いとERK活性化が抑制されていることがわかった。これは、ERKの活性化に必要なスレオニン残基が脱リン酸化されていることを明らかにした。阻害剤を用いた実験により、PPPサブファミリーのセリンスレオニン脱リン酸化酵素がこの細胞密度依存性ERK抑制に寄与している可能性が示唆された。
3.AキナーゼのFRETバイオセンサーを発現するトランスジェニックマウスに腫瘍細胞を接種し、その腫瘍内血管でのPKA活性を測定した。その結果、腫瘍内血管では皮下正常血管と比較するとPKA活性が低く、これが血管透過性の亢進をもたらしていることが示唆された。そこで、PKAの活性をcAMPアナログで上昇させたところ血管透過性が低下した。さらに、血管内皮細胞増殖因子受容体の阻害剤を投与したところPKA活性が上昇し、血管透過性が低下した。これらの結果は、血管内皮細胞増殖因子による血管透過性の少なくとも一部はPKA活性の抑制によることを示している。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

おおむね順調に進んでいるが、トランスジェニックマウスを作成する実験において、発現量が十分でないものがあり、その計画は若干遅れている。

Strategy for Future Research Activity

今後も、トランスジェニックマウスの生体観察と中心に進めていく予定である。

Research Products

• [Journal Article] In Vivo FRET Imaging of Tumor Endothelial Cells Highlights a Role of Low PKA Activity in Vascular Hyperpermeability (2016)
  • Author(s): Yamauchi Fumio、Kamioka Yuji、Yano Tetsuya、Matsuda Michiyuki
  • Journal Title: Cancer Res Volume: 76 Pages: 5266-5276
  • DOI: 10.1158/0008-5472.can-15-3534
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Intravital imaging of mouse urothelium reveals activation of extracellular signal-regulated kinase by stretch-induced intravesical release of ATP (2016)
  • Author(s): Sano T, Kobayashi T, Negoro H, Sengiku A, Hiratsuka T, Kamioka Y, Liou LS, Ogawa O, Matsuda M
  • Journal Title: Physiol Rep Volume: 21
  • DOI: 10.14814/phy2.13033
  • NAID: 120005895398
  • Peer Reviewed / Open Access / Int'l Joint Research
• [Journal Article] Identification of Aging-Associated Gene Expression Signatures That Precede Intestinal Tumorigenesis (2016)
  • Author(s): Okuchi Yoshihisa、Imajo Masamichi、Mizuno Rei、Kamioka Yuji、Miyoshi Hiroyuki、Taketo Makoto Mark、Nagayama Satoshi、Sakai Yoshiharu、Matsuda Michiyuki
  • Journal Title: Plos One Volume: 11
  • DOI: 10.1371/journal.pone.0162300
  • NAID: 120005842701
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] Cell Density-Dependent Increase in Tyrosine-Monophosphorylated ERK2 in MDCK Cells Expressing Active Ras or Raf (2016)
  • Author(s): Kawabata Noriyuki、Matsuda Michiyuki
  • Journal Title: Plos One Volume: 11
  • DOI: 10.1371/journal.pone.0167940
  • NAID: 120005947199
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] Cancer‐specific mutations in p53 induce the translation of Δ160p53 promoting tumorigenesis (2016)
  • Author(s): Marco M Candeias
  • Journal Title: EMBO Rep Volume: 17(11) Pages: 1542-1551
  • DOI: 10.15252/embr.201541956
  • Peer Reviewed / Int'l Joint Research
• [Journal Article] Intercellular propagation of extracellular signal-regulated kinase activation revealed by in vivo imaging of mouse epidermis. (2015)
  • Author(s): Hiratsuka T, Fujita Y, Naoki H, Aoki K, Kamioka Y, Matsuda M
  • Journal Title: eLIFE Volume: - Pages: 1-18
  • DOI: 10.7554/elife.05178
  • NAID: 120005540395
  • Peer Reviewed / Open Access / Acknowledgement Compliant
• [Journal Article] Intravital imaging reveals gow BRAF inhibition generates drugtolerant microenvironments with high integrin beta1/FAK signaling (2015)
  • Author(s): Hirata E, Girotti MR, Viros A, Hooper S, Spencer-Dene B, Matsuda M,
  • Journal Title: Cancer Cell Volume: 27 Pages: 574-88
  • DOI: 10.1016/j.ccell.2015.03.008
  • Peer Reviewed / Open Access / Int'l Joint Research
• [Journal Article] Heterogeneity in ERK activity as visualized by in vivo FRET imaging of mammary tumor cells developed in MMTV-Neu mice. (2015)
  • Author(s): Yuka Kumagai, Honda Naoki, Eiji Nakasyo, Yuji Kamioka, Etsuko Kiyokawa, Michiyuki Matsuda
  • Journal Title: Oncogene. Volume: (ネット上で先行掲載) Pages: 1051-7
  • DOI: 10.1038/onc.2014.28
  • NAID: 120005625616
  • Peer Reviewed / Open Access / Acknowledgement Compliant
• [Presentation] Development of four dimensional histology for live imaging (2017)
  • Author(s): Ayako Imanishi; Masaya Sato; Kenta Terai; Kenta Sumiyama; Kazuhiro Hotta; Michiyuki Matsuda
  • Organizer: The 1st ABiS Symposium
• [Presentation] 高感度のAMPK FRETバイオセンサーを用いた生体内AMPK活性の不均一性 (2017)
  • Author(s): Yumi Konagaya; Kenta Terai; Michiyuki Matsuda
  • Organizer: 第4回発生における代謝を考える会
• [Presentation] A highly sensitive FRET biosensor for AMP-activated protein kinase (AMPK) reveals heterogeneous cellular responses in vitro and in vivo. (2017)
  • Author(s): Yumi Konagaya; Kenta Terai; Michiyuki Matsuda
  • Organizer: 第1回ABiSシンポジウム
• [Presentation] Age-related DNA methylation and altered gene expression precede loss of heterozygosity of the Apc gene in ApcΔ716 mice. (2016)
  • Author(s): Yoshihisa Okuchi
  • Organizer: Tenth AACR-JCA Joint Conference on Breakthrough in Cancer Research: From Biology to Therapeutics
  • Place of Presentation: Hyatt Regency Maui（Maui, U.S.A）
  • Year and Date: 2016-02-17
  • Int'l Joint Research
• [Presentation] In vivo FRET imaging of tumor endothelial cells highlights a role of low PKA activity in vascular hyperpermeability (2016)
  • Author(s): Michiyuki Matsuda
  • Organizer: Lorne Cancer Conference
  • Int'l Joint Research / Invited
• [Presentation] FRETマウスの多光子顕微鏡観察 (2016)
  • Author(s): 松田道行
  • Organizer: 第68回日本細胞生物学会
  • Invited
• [Presentation] 組織細胞間コミュニケーションのライブイメージングに資する細胞形態マーカー発現マウスの作成 (2016)
  • Author(s): 今西彩子、小松直貴、隅山健太、松田道行
  • Organizer: 第68回日本細胞生物学会大会
• [Presentation] Two-photon-excited fluorescence excitation spectra of red fluorophores and fluorescent proteins. (2016)
  • Author(s): Yoshinobu Konishi; Yuji Kamioka and Michiyuki Matsuda
  • Organizer: 第68回日本細胞生物学会
• [Presentation] Visualization of AMPK activity by fluorescence resonance energy transfer-based biosensor in vivo. (2016)
  • Author(s): Yumi Konagaya; Yusuke Hirao; Masamichi Imajo; Yuji Kamioka; Michiyuki Matsuda
  • Organizer: 日本細胞生物学会
• [Presentation] マウス小腸オルガノイドにおけるシグナル伝達経路の解析 (2016)
  • Author(s): 牟田優; 今城正道; 松田道行
  • Organizer: 第68回日本細胞生物学会
• [Presentation] 新規オルガノイド培養法を用いた肝芽腫発生機構の解析 (2016)
  • Author(s): 今城正道、松田道行
  • Organizer: 第68回細胞生物学会大会
• [Presentation] 二光子顕微鏡による腸管腫瘍発生の可視化は正常腸管細胞の不均一性を明らかにする (2015)
  • Author(s): 奥知慶久
  • Organizer: 第74回日本癌学会学術総会
  • Place of Presentation: 名古屋国際会議場(愛知県名古屋市）
  • Year and Date: 2015-10-08
• [Presentation] 変異型ras、raf 導入細胞の細胞密集による抑制 (2015)
  • Author(s): 河鰭憲幸
  • Organizer: 第74回日本癌学会学術総会
  • Place of Presentation: 名古屋国際会議場(愛知県名古屋市）
  • Year and Date: 2015-10-08