ミクロオートファジーの作動・制御機構

• Project Area: Multimode autophagy: Diverse pathways and selectivity
• Project/Area Number: 19H05709
• Research Category: Grant-in-Aid for Scientific Research on Innovative Areas (Research in a proposed research area)
• Allocation Type: Single-year Grants
• Review Section: Biological Sciences
• Research Institution: Kyoto University
• Principal Investigator: 阪井 康能 京都大学, 農学研究科, 教授 (60202082)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 奥 公秀 京都先端科学大学, バイオ環境学部, 准教授 (10511230)
• Project Period (FY): 2019-06-28 – 2024-03-31
• Project Status: Granted (Fiscal Year 2023)
• Budget Amount: ¥86,320,000 (Direct Cost: ¥66,400,000、Indirect Cost: ¥19,920,000); Fiscal Year 2023: ¥16,640,000 (Direct Cost: ¥12,800,000、Indirect Cost: ¥3,840,000); Fiscal Year 2022: ¥15,860,000 (Direct Cost: ¥12,200,000、Indirect Cost: ¥3,660,000); Fiscal Year 2021: ¥18,590,000 (Direct Cost: ¥14,300,000、Indirect Cost: ¥4,290,000); Fiscal Year 2020: ¥11,440,000 (Direct Cost: ¥8,800,000、Indirect Cost: ¥2,640,000); Fiscal Year 2019: ¥23,790,000 (Direct Cost: ¥18,300,000、Indirect Cost: ¥5,490,000)
• Keywords: オートファジー / 液胞 / ミクロオートファジー / リソソーム

Outline of Research at the Start

オートファジーには多くの経路が存在し、かつそれらが連携することで細胞構成成分の分解を機能的に行っていると考えられている。
その中でミクロオートファジーはリソソーム（液胞）またはエンドソームと呼ばれる細胞内小器官の膜が直接変形して細胞質成分を分解に導く経路である。
この研究課題では、複数の酵母種（パン酵母やメタノール資化性酵母）を主な研究対象とし、ミクロオートファジーがどのようにして分解対象を認識するか、ということに加え、他のオートファジー経路などとどのように使い分けられて機能するか、ということを分子レベルで理解することを目指す。

Outline of Annual Research Achievements

ミクロオートファジーとは真核生物細胞のリソソーム（液胞）またはエンドソーム膜が変形して直接細胞質成分を取り込み分解する機構を指し、マルチモードオートファジー（多様なオートファジー経路）の一翼を担っている。本研究課題ではミクロオートファジーの分子機構の理解を進めること、またミクロオートファジーと他のオートファジー経路との機能連関（分担）を明らかにすることを目的としている。特に、これまでに細胞内の様々な膜変形に機能することが知られていたESCRTタンパク質と呼ばれる因子がどのようにミクロオートファジーにおいて機能するかを調べることに注力している。
本年度の研究により、ESCRTタンパク質を対象とした蛍光顕微鏡を用いた局在解析から、本タンパク質がメタノール資化性酵母 Komagataella phaffii のペルオキシソーム特異的ミクロオートファジーに直接的に作用することが強く示唆された。また、本酵母のペルオキシソーム特異的マクロオートファジー機能タンパク質を探索する新たな実験系を構築しそれを利用することで、複数のオートファジー経路に必須の酵素 Phosphatidylinositol 3' kinase （PI3K）のサブユニットタンパク質の同定に成功した。
出芽酵母 Saccharomyces cerevisiae を対象とした研究から、脂肪滴特異的ミクロオートファジーにおけるESCRTタンパク質とユビキチンリガーゼとの機能連関が明らかとなった。すなわちESCRTタンパク質の局在が、昨年度までの本研究課題で同定したユビキチンリガーゼの活性に依存して変化すること、またESCRTタンパク質の一部が脂肪滴に表在することを見出した。これらのことから、ユビキチンリガーゼによるESCRTタンパク質の脂肪滴への呼び込み機能が示唆された。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

近年急速に増えつつあるミクロオートファジー研究報告の多くが、ESCRTタンパク質の関与を報告している。しかしながら、これまでの研究ではESCRTタンパク質は直径約100 nm の小胞を形成して形成膜からくびり切る働きを持つとされており、様々な大きさの細胞小器官を取り込むようなリソソーム（液胞）膜の動態に本タンパク質がどのように機能するのかは不明な点が多い。本年度の研究から、ESCRTタンパク質が膜の変形だけでなく、その前段階にも機能することが示唆されたことにより、その機能がさらに詳細に解明されつつある点が重要な進展である。
メタノール資化性酵母 Komagataella phaffiiはペルオキシソーム特異的オートファジーの様式として、ミクロオートファジー、マクロオートファジーの2つを持つことから、マルチモードオートファジーの機能連関を研究するための最適なモデル生物である。今年度の研究から、これまではマクロオートファジーへの機能が示されていたPI3Kのサブユニットタンパク質がミクロオートファジーにも機能することが明らかとなった。これは本申請者がこれまでの研究で見出してきた、ミクロオートファジーにおける（マクロ）オートファジー様膜新生の過程を実証する新たな証拠であるといえる。

Strategy for Future Research Activity

ミクロオートファジーにおけるESCRTタンパク質およびユビキチンリガーゼの機能をさらに解明するために、本年度はユビキチンリガーゼによってユビキチン鎖を付加されるペルオキシソームや脂肪滴表在タンパク質の同定を目指す。同時にペルオキシソーム特異的ミクロオートファジーにおいて機能するユビキチンリガーゼを探索する。また脂肪滴特異的ミクロオートファジーの初期過程である脂肪滴-液胞膜の相互作用が、これまでに同定したユビキチンリガーゼやESCRTに依存するか調査する。
これまでの本研究課題で見出した、酵母を対象としたミクロオートファジーに関する知見を哺乳類細胞研究にも援用するためには、哺乳類細胞におけるミクロオートファジーモニター実験系の構築が強く望まれる。ミクロオートファジーではリソソーム内腔に輸送されるリソソーム自身の膜も分解されるため、リソソーム膜に局在するタンパク質LAMP1のターンオーバー速度はミクロオートファジー進行の指標となると考えられる。これまでの本課題研究により、哺乳類培養細胞においてLAMP1を蛍光色素でパルスラベルする実験系を構築しているが、未だこのLAMP1プローブの安定発現株が得られていない。本年度は複数の哺乳類培養細胞についてLAMP1プローブの安定発現株の構築を目指す。

Research Products

• [Journal Article] Regulation of Peroxisome Homeostasis by Post-Translational Modification in the Methylotrophic Yeast Komagataella phaffii (2022)
  • Author(s): Ohsawa Shin、Oku Masahide、Yurimoto Hiroya、Sakai Yasuyoshi
  • Journal Title: Frontiers in Cell and Developmental Biology Volume: 10 Pages: 887806-887806
  • DOI: 10.3389/fcell.2022.887806
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] Phosphoregulation of the transcription factor Mxr1 plays a crucial role in the concentration‐regulated methanol induction in <i>Komagataella phaffii</i> (2022)
  • Author(s): Inoue Koichi、Ohsawa Shin、Ito Shinji、Yurimoto Hiroya、Sakai Yasuyoshi
  • Journal Title: Molecular Microbiology Volume: 118 Issue: 6 Pages: 683-697
  • DOI: 10.1111/mmi.14994
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Autophagy as a Survival Strategy for Eukaryotic Microbes Living in the Phyllosphere (2022)
  • Author(s): Shiraishi Kosuke、Sakai Yasuyoshi
  • Journal Title: Frontiers in Plant Science Volume: 13 Pages: 867486-867486
  • DOI: 10.3389/fpls.2022.867486
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] オートファジーからひも解く植物葉面微生物の生存戦略 植物のライフサイクルに伴う棲息環境の変化へ適応するために (2022)
  • Author(s): 白石 晃將, 阪井 康能
  • Journal Title: 化学と生物 Volume: 60 Pages: 2-4
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Physiology of Methylotrophs Living in the Phyllosphere (2021)
  • Author(s): Yurimoto Hiroya、Shiraishi Kosuke、Sakai Yasuyoshi
  • Journal Title: Microorganisms Volume: 9 Issue: 4 Pages: 809-809
  • DOI: 10.3390/microorganisms9040809
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] Methanol sensor Wsc1 and MAP kinase suppress degradation of methanol-induced peroxisomes in methylotrophic yeast (2021)
  • Author(s): Ohsawa Shin、Inoue Koichi、Isoda Takahiro、Oku Masahide、Yurimoto Hiroya、Sakai Yasuyoshi
  • Journal Title: Journal of Cell Science Volume: - Issue: 9
  • DOI: 10.1242/jcs.254714
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] ミクロオートファジー研究の課題 (2020)
  • Author(s): 奥 公秀、阪井康能
  • Journal Title: 医学のあゆみ Volume: 272 Pages: 856-860
• [Journal Article] A peroxisome deficiency-induced reductive cytosol state up-regulates the brain-derived neurotrophic factor pathway (2020)
  • Author(s): Abe Yuichi、Honsho Masanori、Kawaguchi Ryoko、Matsuzaki Takashi、Ichiki Yayoi、Fujitani Masashi、Fujiwara Kazushirou、Hirokane Masaaki、Oku Masahide、Sakai Yasuyoshi、Yamashita Toshihide、Fujiki Yukio
  • Journal Title: Journal of Biological Chemistry Volume: - Issue: 16 Pages: 5321-5334
  • DOI: 10.1074/jbc.ra119.011989
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] Emergence of divergent mechanisms of microautophagy (2019)
  • Author(s): 阪井康能
  • Journal Title: 生化学 Volume: 91 Issue: 5 Pages: 634-642
  • DOI: 10.14952/SEIKAGAKU.2019.910634
  • ISSN: 0037-1017
  • Year and Date: 2019-10-25
• [Presentation] メタノール酵母Komagataella phaffiiにおける非共有結合性複合体Atg12-Atg5のオートファジー制御機構 (2023)
  • Author(s): 光部 雅俊、中辻 拓実、齋藤 敬、奥 公秀、白石 晃將、阪井 康能
  • Organizer: 日本農芸化学会 2023年度大会
• [Presentation] メタノール資化性酵母Komagataella phaffiiにおけるペキソファジー関連遺伝子KpATG14の解析 (2023)
  • Author(s): 有馬 ゆみ、中村 元春、中辻 拓実、奥 公秀、白石 晃將、阪井 康能
  • Organizer: 日本農芸化学会 2023年度大会
• [Presentation] Distribution and survival strategy of methylotrophs in the phyllosphere (2022)
  • Author(s): Yasuyoshi Sakai, Kosuke Shiraishi, Hiroya Yurimoto
  • Organizer: Phyllosphere 2022
  • Int'l Joint Research
• [Presentation] Molecular mechanism and physiological significance of diurnal regulation of pexophagy in methylotrophic yeasts for survival in the phyllosphere (2022)
  • Author(s): Yasuyoshi Sakai
  • Organizer: The 10th International Symposium on Autophagy
  • Int'l Joint Research / Invited
• [Presentation] Molecular dissection of yeast microlipophagy (2022)
  • Author(s): Masahide Oku, Shoya Araki, Yasuyoshi Sakai
  • Organizer: The 10th International Symposium on Autophagy
  • Int'l Joint Research
• [Presentation] C１微生物の生存戦略における分子・細胞基盤の解明と機能開発 (2022)
  • Author(s): 阪井康能
  • Organizer: 日本農芸化学会 関西支部大会 第522回講演会 受賞記念講演
  • Invited
• [Presentation] 農芸化学会賞受賞講演「C1微生物の生存戦略における分子・細胞基盤の解明と機能開発」 (2022)
  • Author(s): 阪井康能
  • Organizer: 日本農芸化学会2022年度大会
  • Invited
• [Presentation] メタノール酵母Komagataella phaffii Atg12-Atg5複合体によるオートファジーの制御 (2022)
  • Author(s): 光部雅俊、中辻拓実、白石晃將、奥 公秀、阪井康能
  • Organizer: 日本農芸化学会2022年度大会
• [Presentation] Role of Autophagy in Adaptation to the Phyllosphere Environment in the Methanol-Utilizing Yeast Candida boidinii (2021)
  • Author(s): Kosuke Shiraishi, Masahide Oku, Hiroya Yurimoto, Yasuyoshi Sakai
  • Organizer: Phyllosphere Fortnight 2021
  • Int'l Joint Research
• [Presentation] Wsc1 and MAP kinase proteins suppress pexophagy in the methylotrophic yeast Komagataella phaffii (2021)
  • Author(s): Koichi Inoue, Shin Ohsawa, Hiroya Yurimoto, Yasuyoshi Sakai
  • Organizer: International Congress on Yeasts (ICY15)
  • Int'l Joint Research
• [Presentation] 温室効果ガスの炭素循環を担うC1 微生物はどのようにして葉面で生きていくのか (2021)
  • Author(s): 阪井康能
  • Organizer: 大隅基礎科学創成財団第5期第1回創発セミナー
  • Invited
• [Presentation] Methanol-induced gene expression: molecular mechanism and application (2021)
  • Author(s): Sakai Yasuyoshi
  • Organizer: Pichia 2021
  • Int'l Joint Research / Invited
• [Book] Peroxisomes: Biogenesis, Function, and Role in Human Disease (2019)
  • Author(s): Masahide Oku, Yasuyoshi Sakai.
  • Total Pages: 279
  • Publisher: Springer
  • ISBN: 9789811511684