Molecular mechanisms and physiological functions of plasma membrane component degradation in animal development

• Project Area: Multimode autophagy: Diverse pathways and selectivity
• Project/Area Number: 19H05711
• Research Category: Grant-in-Aid for Scientific Research on Innovative Areas (Research in a proposed research area)
• Allocation Type: Single-year Grants
• Review Section: Biological Sciences
• Research Institution: Gunma University
• Principal Investigator: 佐藤 健 群馬大学, 生体調節研究所, 教授 (30311343)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 佐藤 裕公 群馬大学, 生体調節研究所, 准教授 (40545571)
• Project Period (FY): 2019-06-28 – 2024-03-31
• Project Status: Granted (Fiscal Year 2023)
• Budget Amount: ¥75,400,000 (Direct Cost: ¥58,000,000、Indirect Cost: ¥17,400,000); Fiscal Year 2023: ¥15,860,000 (Direct Cost: ¥12,200,000、Indirect Cost: ¥3,660,000); Fiscal Year 2022: ¥15,990,000 (Direct Cost: ¥12,300,000、Indirect Cost: ¥3,690,000); Fiscal Year 2021: ¥16,640,000 (Direct Cost: ¥12,800,000、Indirect Cost: ¥3,840,000); Fiscal Year 2020: ¥16,640,000 (Direct Cost: ¥12,800,000、Indirect Cost: ¥3,840,000); Fiscal Year 2019: ¥10,270,000 (Direct Cost: ¥7,900,000、Indirect Cost: ¥2,370,000)
• Keywords: 受精 / エンドサイトーシス / リソソーム / 卵母細胞 / 受精卵 / 細胞膜分解 / 精子 / 卵 / 発生

Outline of Research at the Start

細胞膜は細胞内外の物流やシグナル伝達等の場として重要な役割を担っている。その細胞膜の性質が生理条件下において劇的に変換する局面がある。それが受精、そして胚発生である。我々は線虫、マウスの初期発生過程においてある種の細胞膜成分が選択的に細胞内に取り込まれ分解される現象（細胞膜分解）を見出している。本研究では、このような動物の発生や生理機能と連動した細胞膜分解の分子機構及び生理機能の解明を目指す。

Outline of Annual Research Achievements

(1) 線虫の卵母細胞膜分解に関与する因子の探索と解析
これまでに単離した卵母細胞膜タンパク質の分解に関わる候補因子について解析を進めたところ、ある膜結合型ユビキチンリガーゼの発現抑制により受精後に惹起されるエンドソーム上のユビキチン化が顕著に低下することが明らかとなってきた。このユビキチンリガーゼに対する抗体染色やGFP融合タンパク質の動態解析の結果から、この分子は受精後に表層顆粒から細胞膜へと輸送され、その後、エンドサイトーシスを介して分解されることが明らかとなった。このことから、受精後の細胞膜分解は発生の時間軸におけるユビキチンリガーゼの空間的制御を受けている可能性が示唆された。一方、前年度に同定した受精後に後期エンドソームの活性を制御する候補因子について解析を行ったところ、線虫における生殖顆粒（液滴）であるＰ顆粒に局在することが明らかとなってきた。この因子には線虫に別のホモログが存在するが、この因子の欠損はＰ顆粒の肥大化を惹起することが報告されている。現在、生殖顆粒局在する因子群がどのようにリソソーム分解系を制御するのか解析を進めている。

（２）マウス初期胚における細胞膜分解系の解析
マウス初期胚において働く複数のアミノ酸輸送体に着目し、これらの初期発生過程における細胞内動態を解析したところ、一部の因子について２細胞期後期から選択的に細胞内に取り込まれリソソームにおいて分解されることが明らかとなってきた。また、この取り込みはクラスリン依存的エンドサイトーシスを介して行われ、PKC依存的であることを示した。さらに、前年度に構築した非侵襲的に高解像ライブイメージングにより、マウスの初期発生過程におけるエンドソーム、リソソームの細胞内動態と活性変化について明らかにした。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

これまでに線虫及びマウス受精卵における高解像かつ低侵襲的ライブイメージング系の開発に成功している。また、マウス初期胚における細胞膜タンパク質とエンドソーム・リソソーム系の４次元マッピングを行った。一方、線虫においては卵母細胞膜タンパク質の分解やリソソーム分解系活性化に関与する新規候補因子の同定に成功している。また、マウス初期胚における解析から、線虫だけではなくマウスにおいても初期胚発生期にユビキチン化を介した選択的な細胞膜分解が起こることを見出している。これらのことから、研究計画はおおむね順調に進展していると思われる。

Strategy for Future Research Activity

線虫において発見した受精後に起こるユビキチン化を制御するユビキチンリガーゼに関しては、さらに関連因子の同定および生化学的な活性測定等の詳細な解析を進め、論文発表を目指す。また、新たに同定したＰ顆粒に局在する新規因子についてはこの因子がどのようにして受精卵におけるリソソーム分解系活性化に寄与するのか、遺伝子破壊株の作製、抗体作製、関連因子の同定等を通じて詳細に解析を行う。一方、マウスにおいては、未受精卵および受精卵におけるプロテオーム解析を行い、受精前後においてタンパク量が変動する膜タンパク質やリソソーム分解系の因子を同定し、分解基質となりうる細胞膜タンパク質の同定とリソソーム分解系を制御する因子の同定・解析を行い、研究推進する予定である。

Research Products

• [Int'l Joint Research] シンガポール国立大学(シンガポール)
• [Journal Article] ERdj8 governs the size of autophagosomes during the formation process (2020)
  • Author(s): Yamamoto Yo-hei、Kasai Ayano、Omori Hiroko、Takino Tomoe、Sugihara Munechika、Umemoto Tetsuo、Hamasaki Maho、Hatta Tomohisa、Natsume Tohru、Morimoto Richard I.、Arai Ritsuko、Waguri Satoshi、Sato Miyuki、Sato Ken、Bar-Nun Shoshana、Yoshimori Tamotsu、Noda Takeshi、Nagata Kazuhiro
  • Journal Title: Journal of Cell Biology Volume: 219 Issue: 8 Pages: 1-12
  • DOI: 10.1083/jcb.201903127
  • Peer Reviewed / Open Access / Int'l Joint Research
• [Journal Article] SNAP23 deficiency causes severe brain dysplasia through the loss of radial glial cell polarity (2020)
  • Author(s): Kunii M、Noguchi Y、Yoshimura S、Kanda S、Iwano T、Avriyanti E、Atik N、Sato T、Sato K、Ogawa M、Harada A
  • Journal Title: Journal of Cell Biology Volume: 220 Issue: 1 Pages: 1-21
  • DOI: 10.1083/jcb.201910080
  • Peer Reviewed / Open Access / Int'l Joint Research
• [Journal Article] Structural insights into tetraspanin CD9 function (2020)
  • Author(s): Umeda Rie、Satouh Yuhkoh、Takemoto Mizuki、Nakada-Nakura Yoshiko、Liu Kehong、Yokoyama Takeshi、Shirouzu Mikako、Iwata So、Nomura Norimichi、Sato Ken、Ikawa Masahito、Nishizawa Tomohiro、Nureki Osamu
  • Journal Title: Nature Communications Volume: 11 Issue: 1 Pages: 643-651
  • DOI: 10.1038/s41467-020-15459-7
  • NAID: 120006957458
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] How lysosomal degradation systems function in early embryos (2019)
  • Author(s): 佐藤 美由紀、佐藤 裕公、佐藤 健
  • Journal Title: 生化学 Volume: 91 Issue: 5 Pages: 643-651
  • DOI: 10.14952/SEIKAGAKU.2019.910643
  • ISSN: 0037-1017
  • Year and Date: 2019-10-25
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Synthesis and maintenance of lipid droplets are essential for mouse preimplantation embryonic development (2019)
  • Author(s): Aizawa Ryutaro、Ibayashi Megumi、Tatsumi Takayuki、Yamamoto Atsushi、Kokubo Toshiaki、Miyasaka Naoyuki、Sato Ken、Ikeda Shuntaro、Minami Naojiro、Tsukamoto Satoshi
  • Journal Title: Development Volume: 146 Issue: 22
  • DOI: 10.1242/dev.181925
  • NAID: 120006876601
  • Peer Reviewed
• [Presentation] The mechanism underlying selective elimination of paternal mitochondria in C. elegans (2020)
  • Author(s): Taeko Sasaki, Yasuharu Kushida, Ken Sato, Miyuki Sato
  • Organizer: 第72回日本細胞生物学会
  • Invited
• [Presentation] 初期胚発生におけるリソソーム分解系を介した細胞膜成分リモデリング機構 (2020)
  • Author(s): 佐藤健，佐藤美由紀，佐藤裕公，森田晶人．
  • Organizer: 第93回 日本生化学会大会
  • Invited
• [Presentation] グリシントランスポーターであるGlyt1aは胚発生に伴いRab5/Rab7陽性エンドソームを介してエンドサイトーシスされ分解される (2020)
  • Author(s): 森田晶人，佐藤裕公，佐藤健
  • Organizer: 第38回 日本受精着床学会総会・学術講演会
• [Presentation] 低分子量GTPase Rab35の 神経発生における機能解析 (2020)
  • Author(s): 前島郁子, 原太一, 塚本智史, 古泉博之, 川内健史, 阿久澤共子, 平井里香, 小林久江, 磯部いの八, 榎本和生, 小迫英尊, 佐藤 健
  • Organizer: 第43回日本分子生物学会
  • Invited
• [Presentation] 線虫遺伝学×プロテオミクスのコラボ： 父性オルガネラオートファジー制御機構の解明を目指して (2019)
  • Author(s): 佐藤美由紀，佐藤健，小迫英尊
  • Organizer: 第71回日本細胞生物学会・第19回日本蛋白質科学会年会合同大会
  • Invited
• [Presentation] 初期発生における細胞内オルガネラリモデリング機構 (2019)
  • Author(s): 佐藤健
  • Organizer: 第66回日本実験動物学会総会
  • Invited
• [Presentation] The mechanism of selective elimination of paternal mitochondria via autophagy receptor ALLO-1 (2019)
  • Author(s): Taeko Sasaki, Ken Sato, Miyuki Sato
  • Organizer: 第42回日本分子生物学会年会
  • Invited
• [Book] ミトコンドリアと疾患・老化：受精卵における精子ミトコンドリアの排除機構 (2019)
  • Author(s): 柳 茂：佐藤美由紀、佐藤健
  • Total Pages: 221
  • Publisher: 羊土社
  • ISBN: 9784758103800