Reconstitution of totipotent nuclei in a test tube

• Project Area: Program of totipotency: From decoding to designing
• Project/Area Number: 19H05755
• Research Category: Grant-in-Aid for Scientific Research on Innovative Areas (Research in a proposed research area)
• Allocation Type: Single-year Grants
• Review Section: Biological Sciences
• Research Institution: Institute of Physical and Chemical Research
• Principal Investigator: 新冨 圭史 国立研究開発法人理化学研究所, 開拓研究本部, 専任研究員 (60462694)
• Project Period (FY): 2019-06-28 – 2024-03-31
• Project Status: Granted (Fiscal Year 2023)
• Budget Amount: ¥93,600,000 (Direct Cost: ¥72,000,000、Indirect Cost: ¥21,600,000); Fiscal Year 2023: ¥16,770,000 (Direct Cost: ¥12,900,000、Indirect Cost: ¥3,870,000); Fiscal Year 2022: ¥16,770,000 (Direct Cost: ¥12,900,000、Indirect Cost: ¥3,870,000); Fiscal Year 2021: ¥16,770,000 (Direct Cost: ¥12,900,000、Indirect Cost: ¥3,870,000); Fiscal Year 2020: ¥16,770,000 (Direct Cost: ¥12,900,000、Indirect Cost: ¥3,870,000); Fiscal Year 2019: ¥26,520,000 (Direct Cost: ¥20,400,000、Indirect Cost: ¥6,120,000)
• Keywords: カエル卵抽出液 / 細胞周期 / 再プログラム化 / 染色体 / 再構成 / 核の再プログラム化 / 無細胞系 / 卵割周期 / 胚性遺伝子活性化

Outline of Research at the Start

受精卵では核の構造が大きく変化します。こうして核が再プログラム化されると、細胞があらゆる組織へと分化するポテンシャル「全能性」が得られます。これまで、私たちはカエル卵の抽出液を使って、核の再プログラム化を試験管内で再現する方法を開発し、そのしくみを分子レベルで理解する準備を整えてきました。この研究では、独自の方法を使って、卵に存在するどのタンパク質が、どのような化学反応を通じて、再プログラム化をもたらすのかを明らかにします。さらに、得られた知見をもとにして、さまざまな組織に由来する細胞の核を再プログラム化し、人為的に全能性を与えることにも挑戦します。

Outline of Annual Research Achievements

マウスなどの哺乳類では、体細胞由来の核を除核した卵に移植してクローン個体を作出することができる。しかし、この方法によるクローン作出の成功率は良くても20%程度であり、クローン作出の背景にある分子メカニズムの理解とそれに基づく技術の改良が求められている。本研究では、特に、卵の細胞質に存在する因子がドナー核のクロマチンに働きかけ、DNA複製が開始するまでの過程で起こる生化学反応に着目して解析を行なってきた。これまでに達成した実績の概要は以下の通りである。
（1）実験系の確立。赤血球核をカエル卵から調製した分裂期抽出液と混和すると、核膜崩壊の後に染色体が作られる。さらにその後、抽出液の細胞周期を間期に移行させると、100%の効率でDNA複製が誘起できた。体細胞核と分裂期卵細胞質の相互作用によって、クローン作出に不可欠なクロマチンの質的変化を再現できた。
（2）体細胞核から分裂期染色体への変換に不可欠なタンパク質の絞り込み。通常の増殖細胞での染色体構築に不可欠なコンデンシンやトポⅡ以外の関与を調べた。クロマチンリモデリング因子ISWIを卵抽出液から除くと、赤血球核から作られる染色体様各々の構造が個別化が阻害されることがわかった。
（3）染色体個別化のメカニズムの検討。ISWIによるヌクレオソームのスライディング反応に拮抗的に働くリンカーヒストンH1.8に着目して解析を行った。上記の実験系でH1.8除いた場合には個別化が促進されるのに対し、過剰量のH1.8を添加すると個別化が阻害された。したがって、クローン作出時のクロマチン構造変化には、リンカーヒストンとリモデリング因子にバランスによるヌクレオソームの動的性質の調節が重要であることが示唆された。

Current Status of Research Progress

3: Progress in research has been slightly delayed.

Reason

クローン作出におけるドナー核の動態を解析するために実験系を確立し、クローン作出に不可欠と考えられる卵由来タンパク質の絞り込みに成功した。それらの作用メカニズムに解析も進んでおり、さらに詳細な解析をするために必要となる試料の調製も終えることができた。ただし、最終年度を迎え、成果をまとめて論文にするために、いくつかの解析が必要な状況であるため。

Strategy for Future Research Activity

カエル卵抽出液の無細胞系を用いると、体細胞核移植における核の再プログラム化を試験管内で再現できる。とくに、本計画では、終末分化した体細胞（赤血球）の核を卵割周期に適応させる方法に着目してきた。この方法では、卵抽出液の細胞周期を精緻に操作することが再プログラム化の成否を決めることが知られている。例えば、赤血球核を分裂期抽出液と混和すると、いったん核膜が崩壊した後に、ロッド状の染色体が作られる。さらにその後、間期に移行させて核を再形成させれば、100%の効率でDNA複製が誘起できる。しかし、間期の抽出液に直接赤血球核を加えても複製が起こらない。興味深いことに、実際の核移植ではドナー核を分裂期のレシピエント胚に移植しなければならないことが知られており、卵抽出液と赤血球核を組み合わせた無細胞系は再プログラム化の分子メカニズムを理解するために理想的な実験系と言える。
これまでに行った実験では、赤血球核を分裂期卵抽出液と混和した後、細胞周期を間期へと移行させと、複製の再開だけではなく、核サイズや核膜孔密度の増大、ヘテロクロマチンの核内分布の変化が起こることが明らかになっている。さらに、これらの特徴的な形態変化と分裂期おける染色体の個別化の関連も示唆されている。本年度は、分裂期の染色体個別化を制御するリンカーヒストンとリモデリング因子ISWIを卵抽出液から除去し、それらの変異体に置き換える実験を中心に行う。すでに、解析に必要なリコンビナントタンパク質の調製を終えている。変異体への置換によって、分裂期染色体の個別化、その後の間期における核の形態やDNA複製に、どのような影響が生じるのかを解析する。最終的に得られた結果を総合し、原著論文として発表することを目指す。

Research Products

• [Int'l Joint Research] UC Berkeley(米国)
• [Int'l Joint Research] MRC London Institute of Medical Sciences(英国)
• [Journal Article] Monitering the compaction of single DNA molecules in Xenopus egg extract in real time (2023)
  • Author(s): M. Sun, H. Amiri, A. B. Tong, K. Shintomi, T. Hirano, C. Bustamante, and R. Heald.
  • Journal Title: Proc. Natl. Acad. Sci. USA. Volume: 120 Issue: 12
  • DOI: 10.1073/pnas.2221309120
  • Peer Reviewed / Open Access / Int'l Joint Research
• [Journal Article] Cell cycle-specific loading of condensin I is regulated by the N-terminal tail of its kleisin subunit (2022)
  • Author(s): S. Tane, K. Shintomi, K. Kinoshita, Y. Tsubota, M. M. Yoshida, T. Nishiyama, and T. Hirano
  • Journal Title: eLife Volume: 11
  • DOI: 10.7554/elife.84694
  • Peer Reviewed / Open Access / Int'l Joint Research
• [Journal Article] Solubilization of Mouse Sperm Chromatin for Sequencing Analyses Using a Chaperon Protein (2022)
  • Author(s): Yuko Fukuda, Keishi Shintomi, Kosuke Yamaguchi, Yasuhiro Fujiwara, Yuki Okada
  • Journal Title: Methods in Molecular Biology Volume: 2577 Pages: 161-173
  • DOI: 10.1007/978-1-0716-2724-2_11
  • ISBN: 9781071627235, 9781071627242
  • Peer Reviewed / Int'l Joint Research
• [Journal Article] Molecular dissection of condensin II-mediated chromosome assembly using in vitro assays (2022)
  • Author(s): M. M. Yoshida, K. Kinoshita, Y. Aizawa, S. Tane, D. Yamashita, K. Shintomi, and T. Hirano
  • Journal Title: eLife Volume: 11
  • DOI: 10.7554/elife.78984
  • Peer Reviewed / Open Access / Int'l Joint Research
• [Journal Article] Making Mitotic Chromosomes in a Test Tube (2022)
  • Author(s): Shintomi Keishi
  • Journal Title: Epigenomes Volume: 6 Issue: 3 Pages: 20-20
  • DOI: 10.3390/epigenomes6030020
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] A loop extrusion-independent mechanism contributes to condensin I-mediated chromosome shaping (2022)
  • Author(s): Kinoshita Kazuhisa、Tsubota Yuko、Tane Shoji、Aizawa Yuuki、Sakata Ryota、Takeuchi Kozo、Shintomi Keishi、Nishiyama Tomoko、Hirano Tatsuya
  • Journal Title: Journal of Cell Biology Volume: 221 Issue: 3
  • DOI: 10.1083/jcb.202109016
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] Guiding functions of the C-terminal domain of topoisomerase IIα advance mitotic chromosome assembly (2021)
  • Author(s): Keishi Shintomi and Tatsuya Hirano
  • Journal Title: Nature Communications Volume: - Issue: 1 Pages: 2917-2917
  • DOI: 10.1038/s41467-021-23205-w
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Presentation] 染色体をつくる：物理化学的特性の理解を目指して (2022)
  • Author(s): 新冨圭史
  • Organizer: 第45回日本分子生物学会年
  • Invited
• [Presentation] Biochemical dissection of nuclear reprogramming on somatic cell nuclear transfer (2022)
  • Author(s): Keishi Shintomi
  • Organizer: The International Symposium "Totipotency and Germ Cell Development"（
  • Int'l Joint Research / Invited
• [Presentation] カエル卵を使って見えてきた染色体の構築メカニズム (2022)
  • Author(s): 新冨圭史
  • Organizer: 第93回日本動物学会大会 サテライトシンポジウ
  • Invited
• [Presentation] 細胞周期の再構成は可能か？ (2022)
  • Author(s): 新冨圭史
  • Organizer: 細胞分裂研究会
  • Invited
• [Presentation] カエル卵抽出液を使った体細胞核の再プログラム化 (2022)
  • Author(s): 新冨圭史
  • Organizer: 第74回日本細胞生物学会大会
  • Invited
• [Presentation] カエル卵抽出液をつかって染色体構築におけるヌクレオソームの役割に迫る (2021)
  • Author(s): 新冨圭史
  • Organizer: 第44回日本分子生物学会年会
• [Presentation] Reprogramming somatic cell nuclei in Xenopus egg extracts (2020)
  • Author(s): Keishi Shintomi
  • Organizer: 第93回 日本生化学会大会
  • Invited
• [Presentation] Topoisomerase IIa utilizes its C-terminal domain to work in crowded environments of mitotic chromosome assembly (2020)
  • Author(s): Keishi Shintomi and Tatsuya Hirano
  • Organizer: 第43回 日本分子生物学会年会
  • Invited
• [Remarks] Research Map
  • URL: https://researchmap.jp/k_shintomi/presentations/38977698
• [Remarks] 研究成果に関するプレスリリース
  • URL: https://www.riken.jp/press/2021/20210518_4/index.html