In-cell NMR studies of metalloproteins

• Project Area: Integrated Biometal Science: Research to Explore Dynamics of Metals in Cellular System
• Project/Area Number: 19H05773
• Research Category: Grant-in-Aid for Scientific Research on Innovative Areas (Research in a proposed research area)
• Allocation Type: Single-year Grants
• Review Section: Complex systems
• Research Institution: Tokyo Metropolitan University
• Principal Investigator: 伊藤 隆 東京都立大学, 理学研究科, 教授 (80261147)
• Project Period (FY): 2019-06-28 – 2024-03-31
• Project Status: Granted (Fiscal Year 2023)
• Budget Amount: ¥78,130,000 (Direct Cost: ¥60,100,000、Indirect Cost: ¥18,030,000); Fiscal Year 2023: ¥14,040,000 (Direct Cost: ¥10,800,000、Indirect Cost: ¥3,240,000); Fiscal Year 2022: ¥14,430,000 (Direct Cost: ¥11,100,000、Indirect Cost: ¥3,330,000); Fiscal Year 2021: ¥14,040,000 (Direct Cost: ¥10,800,000、Indirect Cost: ¥3,240,000); Fiscal Year 2020: ¥14,040,000 (Direct Cost: ¥10,800,000、Indirect Cost: ¥3,240,000); Fiscal Year 2019: ¥21,580,000 (Direct Cost: ¥16,600,000、Indirect Cost: ¥4,980,000)
• Keywords: 金属結合タンパク質 / in-cell NMR / 溶液NMR / 常磁性NMR / 立体構造

Outline of Research at the Start

細胞内は多種多様な分子が高密度で存在する「分子クラウディング」状態である．金属結合タンパク質の動態についても，細胞内では，クラウディング環境特有の相互作用（排除体積効果・非特異的相互作用）に加え，様々な「生命金属」イオンとの結合や，機能発現に関わる他の因子との特異的相互作用により強い影響を受けていると予想される．
細胞試料を直接NMR測定するin-cell NMRは，生細胞中タンパク質の動態を原子分解能で解析可能な現存する唯一の手法である．本研究は，in-cell NMRを用いて，金属結合タンパク質が関与する生命現象のin situ解析を行うものである．

Outline of Annual Research Achievements

様々な金属結合タンパク質についてin-cell NMR解析を容易に行うための要素技術の研究を行っている．すなわち，(1)迅速で高感度な多次元NMR測定法，(2)高精度自動NMRデータ解析法，(3)細胞試料のマイクロ培養技術，(4)複合体形成やドメイン間相対配置の解析に資する常磁性NMR解析法の開発である．2022年度は特に(3)と(4)に注力して研究を行った．
「細胞試料のマイクロ培養技術」については，植物培養細胞を用いたin-cell NMRの開発を行った．様々な困難さから，高等植物細胞を用いたin-cell NMR測定例は未だ報告がない．そこでNicotiana tabacum L. cv. Bright Yellow-2を用いてin-cell NMRの確立を目指した．植物細胞の細胞壁は，in-cell NMRで通常用いられる，電気穿孔によるタンパク質導入の障害になるため，細胞壁を酵素処理したプロトプラストに試料を導入する方法を試みた．モデルタンパク質としてヒト由来のユビキチン変異体（hUB3A）を用いた結果，予想以上に良好なスペクトルを得ることができた．
「複合体形成やドメイン間相対配置の解析に資する常磁性NMR解析法の開発」については，ダイズ根粒菌の酸素センサーシステムFixJ-FixL二成分情報伝達系について解析を進めた．FixJは，２つのドメイン（FixJN，FixJC）を持つ．2022年度は，FixL-FixJ相互作用によるFixJ活性化の構造基盤を明らかにするためのNMR解析を行った．FixJに対するFixLの滴定実験からは，FixJNがFixLとの相互作用部位であること，FixJC表面の一部も結合に寄与する可能性があることが示された．FixJにFixLとATPを添加した実験では，FixJのリン酸化部位と構造上の近傍領域に顕著な化学シフトが認められた．

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

本研究では，「生命金属科学研究基盤構築」として，in-cell NMR解析系の確立を，また「測定解析法の高度化」として，最先端の溶液NMR測定・解析手法，情報科学を用いたタンパク質の立体構造解析法などをさらに高度化することを計画し，これに従って2022年度の研究を進めた．
2022年度は，その結果として，in-cell NMRおよび溶液状態のNMRについて要素技術開発で良好な結果を得ることができた．
また，新しい要素技術を用いた応用研究においても，ヒトGRB2蛋白質の立体構造決定とSOS1蛋白質との相互作用解析など，生物学的にも興味深い成果が得られた．
さらに，NMRを用いたFixJの溶液構造の解析，およびFixJとFixLの相互作用解析など，領域内の共同研究も順調に進捗している．
以上のことから，2022年度に計画していた研究の多くについては当初の計画に従って推移しており，また本新学術領域内の他の研究者の研究にも利用できる技術の開発も進んでいることから，本研究は全体としておおむね順調に進展していると考えられる．

Strategy for Future Research Activity

今後は，計画の修正を適宜行いつつ研究を継続し，(1) in-cell NMRの手法開発と高度化，(2) in-cell NMRを用いた金属動態に関わるタンパク質の解析（実証研究），(3) in-cell NMRを用いた応用研究，ついて研究を進めていく．
(1)については，疾病を背景に持つ多様な培養細胞を用いたin-cell NMRの方法論的開発を継続する．さらに，2022年度に開発したBY-2細胞を用いた植物培養細胞を用いた系の最適化を進め，植物由来のタンパク質のin-cell NMR解析に挑戦する．
(2)については，領域内の共同研究を通じて金属動態関連タンパク質に適用することで，前項で述べた手法の堅牢性を検証しつつ，実証研究をさらに行っていく．
(3)については，in-cell NMRを用いた，疾病原因遺伝子産物と阻害剤候補分子の結合の「その場観察」の応用研究を継続して行う．具体的には，SARS-CoV-2 mainproteaseと阻害剤の相互作用解析や，ヒトKRASとエフェクター分子との相互作用解析を計画している．
以上に加えて，単離精製された試料のための溶液NMR手法についても，ニーズに合わせた開発研究を行うことで，測定解析法の高度化を推進していく．

Research Products

• [Int'l Joint Research] University of Cambridge/University of Leicester(英国)
• [Int'l Joint Research] Goethe University Frankfurt(ドイツ)
• [Int'l Joint Research] ETH Zurich(スイス)
• [Int'l Joint Research] University of Cambridge/University of Leicester(英国)
• [Int'l Joint Research] Goethe University Frankfurt(ドイツ)
• [Int'l Joint Research] ETH Zurich(スイス)
• [Int'l Joint Research] University of Cambridge/University of Leicester(英国)
• [Int'l Joint Research] Goethe University Frankfurt(ドイツ)
• [Int'l Joint Research] ETH Zurich(スイス)
• [Int'l Joint Research] University of Cambridge/University of Leicester(英国)
• [Int'l Joint Research] Goethe University Frankfurt(ドイツ)
• [Int'l Joint Research] ETH Zurich(スイス)
• [Journal Article] Structural and biochemical insights into heterotetramer formation of oncogenic K-Ras4BG12V and Rgl2, a RalA/B activator (2023)
  • Author(s): 02.Tariq, M., Ikeya, T., Togashi, N., Fairall, L., Bueno-Alejo, C., Kamei, S., Romartinez-Alonso, B., Campillo, M.A.M., Hudson, A. J., Ito, Y., Schwabe, J.W.R., Dominguez, C. & Tanaka, K.
  • Journal Title: bioRxiv Volume: 1 Pages: 1-56
  • DOI: 10.1101/2022.10.10.511529
  • Open Access / Int'l Joint Research
• [Journal Article] Insight into the C-terminal SH3 domain mediated binding of Drosophila Drk to Sos and Dos (2022)
  • Author(s): Sayeesh P.M., Ikeya, T., Sugasawa, H., Watanabe, R., Mishima, M., Inomata, K., & Ito, Y.
  • Journal Title: Biochem. Biophys. Res. Commun. Volume: 625 Pages: 87-93
  • DOI: 10.1016/j.bbrc.2022.08.007
  • Peer Reviewed / Open Access / Int'l Joint Research
• [Journal Article] Structural Biology Studies to Understand the Mechanism of SARS-CoV-2 Infection (2021)
  • Author(s): 伊藤 隆
  • Journal Title: Earozoru Kenkyu Volume: 36 Issue: 4 Pages: 237-245
  • DOI: 10.11203/jar.36.237
  • NAID: 130008132519
  • ISSN: 0912-2834, 1881-543X
  • Year and Date: 2021-12-20
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] Structural basis of the protochromic green/red photocycle of the chromatic acclimation sensor RcaE (2021)
  • Author(s): Takayuki Nagae, Masashi Unno, Taiki Koizumi, Yohei Miyanoiri, Tomotsumi Fujisawa, Kento Masui, Takanari Kamo, Kei Wada, Toshihiko Eki, Yutaka Ito, Yuu Hirose, Masaki Mishima
  • Journal Title: Proceedings of the National Academy of Sciences Volume: 118(20) Issue: 20
  • DOI: 10.1073/pnas.2024583118
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] Multi-state structure determination and dynamics analysis reveals a new ubiquitin-recognition mechanism in yeast ubiquitin C-terminal hydrolase (2021)
  • Author(s): Okada, M., Tateishia, Y., Nojiri, E., Mikawa, T., Rajesh, S., Ogasa, H., Ueda, T., Yagi, H., Kohno, T., Kigawa, T., Shimada, I., Guentert, P., Ito, Y., & Ikeya, T.
  • Journal Title: biorxiv Volume: 2021.04.22.440356 Pages: 1-39
  • DOI: 10.1101/2021.04.22.440356
  • Open Access / Int'l Joint Research
• [Journal Article] 溶液NMR法を用いた蛋白質立体構造計算の最近の動向 (2021)
  • Author(s): 池谷鉄兵，伊藤 隆
  • Journal Title: 細胞 Volume: 53 Pages: 48-52
  • NAID: 40022675452
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] 溶液NMR法を用いた蛋白質立体構造計算の最近の動向 (2021)
  • Author(s): 池谷鉄兵，伊藤 隆
  • Journal Title: アグリバイオ Volume: 5 Pages: 980-986
  • NAID: 40022675452
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Domain selective labeling for NMR studies of multidomain proteins by domain ligation using highly active sortase A (2020)
  • Author(s): Aizu Takahiro、Suzuki Takumi、Kido Akihiro、Nagai Kan、Kobayashi Ayaho、Sugiura Reiko、Ito Yutaka、Mishima Masaki
  • Journal Title: Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - General Subjects Volume: 1864 Issue: 2 Pages: 129419-129419
  • DOI: 10.1016/j.bbagen.2019.129419
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] In-cell NMR as a sensitive tool to monitor physiological condition of Escherichia coli (2020)
  • Author(s): Sugiki Toshihiko、Yamaguchi Yoshihiro、Fujiwara Toshimichi、Inouye Masayori、Ito Yutaka、Kojima Chojiro
  • Journal Title: Scientific Reports Volume: 10 Issue: 1 Pages: 2466-2466
  • DOI: 10.1038/s41598-020-59076-2
  • NAID: 120006952208
  • Peer Reviewed / Open Access / Int'l Joint Research
• [Journal Article] In situ structural biology using in-cell NMR (2020)
  • Author(s): Nishida Noritaka、Ito Yutaka、Shimada Ichio
  • Journal Title: Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - General Subjects Volume: 1864 Issue: 2 Pages: 129364-129364
  • DOI: 10.1016/j.bbagen.2019.05.007
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] High resolution protein 3D structure determination in living eukaryotic cells (2019)
  • Author(s): Tanaka, T., Ikeya, T., Kamoshida, H., Suemoto, Y., Mishima, M., Shirakawa, M., Guentert, P., Ito, Y.
  • Journal Title: Angewandte Chemie International Edition Volume: in press Issue: 22 Pages: 1-7
  • DOI: 10.1002/anie.201900840
  • Peer Reviewed / Int'l Joint Research
• [Journal Article] Protein Structure Determination in Living Cells. (2019)
  • Author(s): Teppei Ikeya, Peter Guentert, Yutaka Ito
  • Journal Title: international journal of molecular sciences Volume: 20 Issue: 10 Pages: 2442-2442
  • DOI: 10.3390/ijms20102442
  • Peer Reviewed / Open Access / Int'l Joint Research
• [Presentation] Protein structure determination by NMR: conformational multiplicity and the effects of macromolecular crowding (2022)
  • Author(s): Yutaka Ito
  • Organizer: The 7th International Symposium on Drug Discovery and Design by NMR
  • Int'l Joint Research / Invited
• [Presentation] Solution NMR approaches to 3D structure determination of proteins in living cells (2022)
  • Author(s): Yutaka Ito
  • Organizer: The Protein Society Webinar “Exploring Proteins in Living Cells”
  • Int'l Joint Research / Invited
• [Presentation] 常磁性ランタノイド金属を用いた蛋白質の溶液NMRおよびin-cell NMR解析 (2022)
  • Author(s): 伊藤 隆
  • Organizer: 第1回生命金属科学シンポジウム
  • Invited
• [Presentation] Protein behaviours under intracellular crowding environments (2022)
  • Author(s): Yutaka Ito
  • Organizer: TMU Workshop on Protein NMR
  • Invited
• [Presentation] シアノバクテリアの光センサーにおける脱プロトン化した塩基性アミノ酸の観測 (2022)
  • Author(s): 永江 峰幸，飯塚 佑介，青山 洋史，宮ノ入 洋平，神野 智司，伊藤 隆，広瀬 侑，三島 正規
  • Organizer: 第61回NMR討論会
• [Presentation] NMR解析を用いた解糖系酵素PGKの環境適応的活性制御による解糖系調節機構 (2022)
  • Author(s): 八木 宏昌，葛西 卓磨，Elisa Rioual，池谷 鉄兵，木川 隆則
  • Organizer: 第61回NMR討論会
• [Presentation] NMR studies of a Drosophila adapter protein, Drk (2022)
  • Author(s): Sayeesh, PM, Teppei Ikeya, Haruka Sugasawa, Riki Watanabe, Yutaka Ito
  • Organizer: 第1回生命金属科学シンポジウム
• [Presentation] In-cell NMRによるlinear diubiquitinのin-situ立体構造解析 (2022)
  • Author(s): 屋部 祥大，田岸 亮馬，鴨志田 一，美川 務，猪股 晃介，池谷 鉄兵，伊藤 隆
  • Organizer: 第61回NMR討論会
• [Presentation] In-cell NMR によるKeap1/Nrf2系の研究 (2022)
  • Author(s): 豊田 芽生，猪股 晃介，末広 志織，島 海翔，池谷 鉄兵，鈴木 隆史，山本 雅之，伊藤 隆
  • Organizer: 第61回NMR討論会
• [Presentation] 常磁性 NMR を用いた根粒菌マルチドメイン蛋白質FixJの立体構造解析 (2022)
  • Author(s): 大久保 里佳，池谷 鉄兵，渡邉 吏輝，菱倉 直樹，三島 正規，猪股 晃介，小手石 泰康，澤井 仁美，城 宣嗣，伊藤 隆
  • Organizer: 第61回NMR討論会
• [Presentation] マルチドメイン蛋白質GRB2とSOS1-PRM領域の相互作用解析 (2022)
  • Author(s): 館野 桂太，菅澤 はるか，安藤 考史，田端 真彩子，美川 務，猪股 晃介，甲斐荘 正恒，三島 正規，杉田 有治，池谷 鉄兵，伊藤 隆
  • Organizer: 第61回NMR討論会
• [Presentation] 常磁性NMRを用いたマルチドメイン蛋白質GRB2の立体構造解析 (2022)
  • Author(s): 安藤 考史，菅澤 はるか，館野 桂太，田端 真彩子，美川 務，宮野入 洋平，川端 庸平，Hisham Dokainish，Weitong Ren，大出 真央，寺内 勉，猪股 晃介，三島 正規，甲斐荘 正恒，杉田 有治，池谷 鉄兵，伊藤 隆
  • Organizer: 第61回NMR討論会
• [Presentation] GMPPNP結合型K-RasG12VとRgl2RBDの相互作用解析 (2022)
  • Author(s): 富樫 直之，宮田 裕貴，亀井 駿，菅澤 はるか，美川 務，猪股 晃介，田仲 加代子，伊藤 隆，池谷 鉄兵
  • Organizer: 第61回NMR討論会
• [Presentation] Solution NMR approaches to investigating protein behaviours under intracellular crowding environments (2022)
  • Author(s): Yutaka Ito
  • Organizer: 29th International Conference on Magnetic Resonance in Biological Systems
  • Int'l Joint Research / Invited
• [Presentation] Solution NMR approaches to 3D structure determination of proteins in living eukaryotic cells (2021)
  • Author(s): Yutaka Ito, Kohsuke Inomata, Teppei Ikeya
  • Organizer: 22nd International Society of Magnetic Resonance Conference (ISMAR)
  • Int'l Joint Research / Invited
• [Presentation] 複数の異なる NMR データの統合解析によるタンパク質 multi-state 立体構造解析 (2021)
  • Author(s): 池谷 鉄兵，伊藤 隆
  • Organizer: 第21回日本蛋白質科学会年会
  • Invited
• [Presentation] Multi-state structure determination and dynamics analysis reveals a new ubiquitin-recognition mechanism in yeast ubiquitin C-terminal hydrolase (2021)
  • Author(s): Teppei Ikeya, Mayu Okada, Yutaka Tateishi, Eri Nojiri, Tsutomu Mikawa, Sundaresan Rajesh, Hiroki Ogasa, Takumi Ueda, Hiromasa Yagi, Toshiyuki Kohno, Takanori Kigawa, Ichio Shimada, Peter G?ntert, Yutaka Ito
  • Organizer: 22nd International Society of Magnetic Resonance Conference (ISMAR)
  • Int'l Joint Research
• [Presentation] Insight into the C-terminal SH3 mediated binding of Drosophila Drk towards Sos and Dos (2021)
  • Author(s): Sayeesh. P. M., Teppei Ikeya, Haruka Sugasawa, Riki Watanabe, Yutaka Ito
  • Organizer: 22nd International Society of Magnetic Resonance Conference (ISMAR)
  • Int'l Joint Research
• [Presentation] Insight into the C-terminal SH3 mediated binding of Drosophila Drk towards Sos and Dos (2021)
  • Author(s): Sayeesh. P. M., Teppei Ikeya, Haruka Sugasawa, Riki Watanabe, Yutaka Ito
  • Organizer: 第44回日本分子生物学会
• [Presentation] NMRによるKRASとRGL2の相互作用解析 (2021)
  • Author(s): 富樫直之，亀井駿，菅澤はるか，猪股晃介，伊藤隆，田仲加代子，池谷鉄兵
  • Organizer: 第44回日本分子生物学会
• [Presentation] 直鎖状ユビキチン二量体の溶液構造解析 (2021)
  • Author(s): 屋部 祥大，田岸亮馬，鴨志田一，美川務，猪股晃介，池谷鉄兵，伊藤隆
  • Organizer: 第44回日本分子生物学会
• [Presentation] In-cell NMRを用いたKeap1-Nrf2制御系の解析 (2021)
  • Author(s): 末広志織，猪股晃介，豊田芽生，池谷鉄兵，鈴木隆史，山本 雅之，伊藤隆
  • Organizer: 第44回日本分子生物学会
• [Presentation] Solution NMR approaches to investigating protein behaviours under intracellular crowding environments (2021)
  • Author(s): Yutaka Ito, Teppei Ikeya
  • Organizer: The International Chemical Congress of Pacific Basin Societies 2020
  • Int'l Joint Research / Invited
• [Presentation] Solution NMR Approaches to Investigating Protein Behaviours under Intracellular Crowding Environments (2021)
  • Author(s): Yutaka Ito, Kohsuke Inomata, Teppei Ikeya
  • Organizer: 22nd International Society of Magnetic Resonance Conference, the 9th Asia-Pacific NMR Symposium
  • Int'l Joint Research / Invited
• [Presentation] 複数の異なるNMR データの統合解析によるタンパク質multi-state 立体構造解析 (2020)
  • Author(s): 池谷 鉄兵，伊藤 隆
  • Organizer: 第58回日本生物物理学会
  • Invited
• [Presentation] Solution NMR approaches to 3D structure determination of proteins in living eukaryotic cells (2019)
  • Author(s): Ito Yutaka, Ikeya Teppei
  • Organizer: 33rd Annual Symposium of the Protein Society, Seattle, USA
  • Int'l Joint Research / Invited
• [Presentation] High resolution protein 3D structure determination in living eukaryotic cells (2019)
  • Author(s): Ito Yutaka, Ikeya Teppei
  • Organizer: The 8th Asia Pacific NMR Symposium, Singapore
  • Int'l Joint Research / Invited
• [Presentation] High-resolution protein 3D structure determination in living eukaryotic cells (2019)
  • Author(s): Tanaka Takashi, Ikeya Teppei, Mishima Masaki, Ito Yutaka
  • Organizer: The 12th Australian and New Zealand Society for Magnetic Resonance Conference (ANZMAG conference 2019), Cape Naturaliste, Australia
  • Int'l Joint Research / Invited
• [Presentation] 溶液NMRを用いたin situ構造生物学 (2019)
  • Author(s): 伊藤 隆，池谷鉄兵
  • Organizer: 第13回バイオ関連化学シンポジウム2019
  • Invited
• [Presentation] Solution NMR approaches to 3D structure determination of proteins in living eukaryotic cells (2019)
  • Author(s): 伊藤 隆，池谷鉄兵
  • Organizer: 第42回日本分子生物学会年会 シンポジウム「In-cell protein scienceのフロンティア」
  • Invited
• [Book] 生命金属ダイナミクス―生体内における金属の挙動と制御 (2021)
  • Author(s): 津本浩平，城宜嗣，他
  • Total Pages: 511
  • Publisher: エヌ・ティー・エス
  • ISBN: 4860437063
• [Book] In-cell NMR Spectroscopy: From Molecular Sciences to Cell Biology (2019)
  • Author(s): Ito Yutaka, Doetsch Volker, Shirakawa Masahiro
  • Total Pages: 305
  • Publisher: Royal Society of Chemistry
  • ISBN: 9781788012171