Shooting Molecular Movies of Enzyme Reactions

• Project Area: Non-equilibrium-state molecular movies and their applications
• Project/Area Number: 19H05780
• Research Category: Grant-in-Aid for Scientific Research on Innovative Areas (Research in a proposed research area)
• Allocation Type: Single-year Grants
• Review Section: Complex systems
• Research Institution: Tottori University
• Principal Investigator: 永野 真吾 鳥取大学, 工学研究科, 教授 (60286440)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 中津 亨 和歌山県立医科大学, 薬学部, 教授 (50293949) ; 溝端 栄一 大阪大学, 大学院工学研究科, 講師 (90571183)
• Project Period (FY): 2019-06-28 – 2024-03-31
• Project Status: Granted (Fiscal Year 2023)
• Budget Amount: ¥134,290,000 (Direct Cost: ¥103,300,000、Indirect Cost: ¥30,990,000); Fiscal Year 2023: ¥23,920,000 (Direct Cost: ¥18,400,000、Indirect Cost: ¥5,520,000); Fiscal Year 2022: ¥23,400,000 (Direct Cost: ¥18,000,000、Indirect Cost: ¥5,400,000); Fiscal Year 2021: ¥25,740,000 (Direct Cost: ¥19,800,000、Indirect Cost: ¥5,940,000); Fiscal Year 2020: ¥25,740,000 (Direct Cost: ¥19,800,000、Indirect Cost: ¥5,940,000); Fiscal Year 2019: ¥35,490,000 (Direct Cost: ¥27,300,000、Indirect Cost: ¥8,190,000)
• Keywords: 酵素反応メカニズム / X線自由電子レーザー / ディールスアルダー反応 / 発光タンパク質 / 分子動画 / 酵素 / Rubisco / 結晶構造解析 / 反応メカニズム / 結晶構造 / 酵素反応 / メカニズム / XFEL / 微結晶 / 時分割X線結晶構造解析

Outline of Research at the Start

酵素が機能する仕組みを明らかにするためには、その反応が起こりつつある非平衡状態の反応場の構造を高い空間・時間分解能で解析することが必須である。本研究では、研究代表者と分担者らがすでに結晶構造を決定した分子内ディールスアルダー環化反応を行う酵素，光合成炭酸固定の鍵酵素Rubisco，および発光タンパク質イクオリンを対象に、南後班で開発する温度ジャンプ法や二液混合法など光トリガーに依存しない手法、および清中班と共同で開発する光作動性を付与したケージド基質を用いる手法を駆使して酵素反応を同期的に進行させ、酵素が基質を巧みに操り化学反応を進める過程を、高い時間・空間分解能で解析する。

Outline of Annual Research Achievements

各研究者それぞれの研究実績を以下にまとめる。

ディールスアルダー反応を行う酵素Fsa2, Phm7に関して，SFXに適した低塩濃度で微結晶を作製し，また結晶格子が揃った微結晶を作製することでこれまでの課題を解決するため，酵素表面に存在する柔軟なアミノ酸やループを置換，欠損させた変異体の作成を進めた。また，タウリン水酸化酵素TauDの金属フリー微結晶にFe(II)を添加し，活性部位を再構成できることを確認した。
イクオリン微結晶懸濁溶液とカルシウム溶液を混合して反応を開始したのち、SACLAのXFELを用いた２液混合SFX実験により、X線回折強度データの収集に成功した。構造解析の結果、カルシウムが２個ないしは３個結合した構造が明らかとなり、カルシウムが結合することによる構造変化がはじめて明らかとなった。
2021年度は、SACLAの光源を用いて、非活性型Rubisco－sulfate複合体、活性型Rubisco－sulfate複合体、活性型Rubisco－生成物3PGA複合体の結晶構造を決定した。これらの構造は触媒部位に存在するLoop 6が閉鎖型または開放型のコンフォメーションを取っていた。これらの構造と比較することで、2020年度に構造決定した活性型リガンドフリーRubiscoのLoop 6が従来の閉鎖型または開放型のいずれにも該当しないユニークなのコンフォメーションを有することを明らかにした。
また、二液混合型インジェクターを用いて、活性型リガンドフリーRubiscoの微結晶に基質RuBPを添加して触媒反応を誘起して時分割構造解析をするための条件検討を行い、コントロールとなる構造を決定した。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

Phm7の表面に存在するループを欠損した変異体をいくつか作製し，そのなかのひとつの変異体で，これまでの結晶化条件とは異なり，PEG8000を沈殿剤とした低塩濃度の条件で結晶を得ることができた。また，TauDでは，金属フリーの微結晶にFe(II)溶液を添加して高粘度媒体を用いた静的SFX実験を行い，活性部位にFe(II)が結合した結晶構造を確認することができた。つまり，二液混合TR-SFX実験によりTauDの酵素反応過程の動画撮影の準備が整いつつある。
イクオリン微結晶を用いた発光実験を行った結果、発光最大値に到達するまでに５秒前後必要であることがわかった。この時間スケールは２液混合時分割SFX実験の実施には適しているということがわかった。そこで長辺が10μm程度のイクオリン結晶とカルシウムを反応させ、反応５秒後において２液混合SFX実験を実施した。その結果、立体構造を2.0A分解能で決定でき、カルシウムが２個、ないしは３個結合し、構造変化が生じている領域が明らかとなった。またカルシウムで反応を進行させた結晶を液体窒素につけることにより、低温トラップする。すなわち異なる反応時間で反応を止めた結晶を複数作成し、それぞれの結晶をSPring-8でX線回折強度データを収集する手法を確立した。

SACLAを利用して、Rubiscoのリガンド複合体の構造を新たに３つ解析できたことで、活性型リガンドフリーRubiscoの構造的特徴の新規性を実証できたことは重要な成果である。
また、二液混合実験に着手してコントロール構造の決定をするなど、今後の分子動画撮影に向けた順調な進捗にあるといえる。

Strategy for Future Research Activity

新たに見出した低塩濃度条件で得られるPhm7微結晶や，すでに得られているFsa2結晶を用いて生成物結合型の結晶構造を決定し，MDシミュレーションで推定された基質結合様式との整合性を確認する。また，Fsa2の基質の有機合成を清中班の永澤グループに依頼しており，その合成が順調に進んでいる。この合成基質を用いて，微結晶試料を用いた酵素活性の確認や，基質結合型の構造決定を目指す。
今回データ収集した時間の前後の時間のデータ収集を行う。また反応の同調性をより高めるために、さらに小さな微結晶を準備し解析を行う。ただし、２液混合実験を実施するためにはサンプル量が膨大になりすぎること、ビームタイムが少ないことから、SPring-8を用いた時分割解析データも組み合わせていくことにより、より詳細な反応メカニズムの解明を目指す。二液混合型インジェクターを用いて、活性型リガンドフリーRubiscoの微結晶に基質RuBPを添加して触媒反応を誘起させ、遅れ時間500 ms未満の時間範囲において時分割構造解析を実施し、触媒部位にRuBPが結合する構造遷移を解明する。
また、活性型Rubisco-RuBP複合体の結晶を低温（0℃以下）で作製する条件を探索し、RuBPにCO2が結合する触媒反応過程を解析するための準備を進める。

Research Products

• [Journal Article] Crystal structures of a 6-dimethylallyltryptophan synthase, IptA: Insights into substrate tolerance and enhancement of prenyltransferase activity (2022)
  • Author(s): Hironori Suemune, Doukan Nishimura, Kenjiro Mizutani, Yusuke Sato, Tomoya Hino, Hiroshi Takagi, Yumi Shiozaki-Sato, Shunji Takahashi*, Shingo Nagano*
  • Journal Title: Biochem. Biophys. Res. Commun. Volume: 593 Pages: 144-150
  • DOI: 10.1016/j.bbrc.2022.01.018
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Crystal structure of the adenylation domain from an ε-poly-l-lysine synthetase provides molecular mechanism for substrate specificity (2022)
  • Author(s): Takaki Okamoto, Kazuya Yamanaka, Yoshimitsu Hamano, Shingo Nagano, TomoyaHino*
  • Journal Title: Biochem. Biophys. Res. Commun. Volume: 596 Pages: 43-48
  • DOI: 10.1016/j.bbrc.2022.01.053
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Heavy Atom Detergent/Lipid Combined X-ray Crystallography for Elucidating the Structure-Function Relationships of Membrane Proteins (2021)
  • Author(s): Shinya Hanashima, Takanori Nakane, Eiichi Mizohata*
  • Journal Title: Membranes (Basel) Volume: 11(11) Issue: 11 Pages: 823-823
  • DOI: 10.3390/membranes11110823
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] Molecular Basis for Two Stereoselective Diels-Alderases that Produce Decalin Skeletons (2021)
  • Author(s): Fujiyama Keisuke、Kato Naoki、Re Suyong、Kinugasa Kiyomi、Watanabe Kohei、Takita Ryo、Nogawa Toshihiko、Hino Tomoya、Osada Hiroyuki、Sugita Yuji、Takahashi Shunji、Nagano Shingo
  • Journal Title: Angewandte Chemie International Edition Volume: 60 Issue: 41 Pages: 22401-22410
  • DOI: 10.1002/anie.202106186
  • Peer Reviewed / Open Access / Int'l Joint Research
• [Journal Article] The crystal structure of the CmABCB1 G132V mutant, which favors the outward‐facing state, reveals the mechanism of the pivotal joint between TM1 and TM3 (2021)
  • Author(s): Matsuoka Keita、Nakatsu Toru、Kato Hiroaki
  • Journal Title: Protein Science Volume: 30 Issue: 5 Pages: 1064-1071
  • DOI: 10.1002/pro.4058
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Crystal structure of CmABCB1 multi-drug exporter in lipidic mesophase revealed by LCP-SFX (2021)
  • Author(s): Pan Dongqing、Oyama Ryo、Sato Tomomi、Nakane Takanori、Mizunuma Ryo、Matsuoka Keita、Joti Yasumasa、Tono Kensuke、Nango Eriko、Iwata So、Nakatsu Toru、Kato Hiroaki
  • Journal Title: IUCrJ Volume: 9 Issue: 1 Pages: 134-145
  • DOI: 10.1107/s2052252521011611
  • NAID: 120007179308
  • Peer Reviewed / Open Access / Int'l Joint Research
• [Journal Article] ABCB1/MDR1/P‐gp employs an ATP‐dependent twist‐and‐squeeze mechanism to export hydrophobic drugs (2020)
  • Author(s): Kodan Atsushi、Futamata Ryota、Kimura Yasuhisa、Kioka Noriyuki、Nakatsu Toru、Kato Hiroaki、Ueda Kazumitsu
  • Journal Title: FEBS Letters Volume: 595 Issue: 6 Pages: 707-716
  • DOI: 10.1002/1873-3468.14018
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Presentation] Protein X-ray crystallography at Japanese X-ray free electron laser facility, SACLA (2022)
  • Author(s): ○中津 亨
  • Organizer: Japan-Korea Dynamic Mechanism of Proteins Online International Symposium
• [Presentation] CO2固定酵素RuBisCOの分子動画撮影条件の検討 (2021)
  • Author(s): ◯清田雄大、熊野翔太、溝端栄一
  • Organizer: 令和三年度 新学術領域研究「高速分子動画」シンポジウム
• [Presentation] Damage-free protein observation and structure determination using X-ray free electron laser (2021)
  • Author(s): ○Eiichi Mizohata
  • Organizer: Pacifichem 2021
  • Int'l Joint Research / Invited
• [Presentation] 立体選択的なDiels-Alder反応によりデカリン骨格を構築する酵素の分子機構 (2021)
  • Author(s): 〇永野真吾
  • Organizer: 第47回生体分子科学討論会
  • Invited
• [Presentation] スクアレン合成酵素に類似した放線菌由来新規カルバゾールプレニル基転移酵素の結晶構造と反応機構 (2021)
  • Author(s): 〇末宗周憲, 永田 隆平, 小林 正弥, 品田 哲郎, 西山 真, 葛山 智久, 佐藤裕介, 日野 智也, 永野 真吾
  • Organizer: 第21回日本蛋白質科学会年会
• [Presentation] ジャガイモやトマトに含まれる有毒なスピロソランを 代謝変換する16位水酸化酵素と20位脱水素酵素の反応メカニズム (2021)
  • Author(s): 〇宮崎麻紗美, 藤山敬介, 佐藤祐介, 日野智也, 水谷正治, 秋山遼太, 加藤純平, 重田育照, 庄司光男, 永野真吾
  • Organizer: 第21回日本蛋白質科学会年会
• [Presentation] スクアレン合成酵素に類似した放線菌由来新規カルバゾールプレニル基転移酵素の結晶構造と反応機構 (2021)
  • Author(s): 〇末宗周憲, 永田 隆平, 小林 正弥, 品田 哲郎, 西山 真, 葛山 智久, 佐藤裕介, 日野 智也, 永野 真吾
  • Organizer: 第15回バイオ関連化学シンポジウム
• [Presentation] トマチンを代謝する2種類の酸化酵素の結晶構造が示す意外な分子メカニズム (2021)
  • Author(s): 〇宮崎麻紗美, 藤山敬介, 佐藤祐介, 日野智也, 水谷正治, 秋山遼太, 加藤純平, 重田育照, 庄司光男, 永野真吾,
  • Organizer: 令和3年 (2021年) 度 日本結晶学会年会
• [Presentation] タウリン水酸化酵素の時分割シリアルフェムト秒X線結晶構造解析に向けた微結晶化と構造解析 (2021)
  • Author(s): 〇三坂圭生,宮﨑麻紗美,日野智也,佐藤裕介,永野真吾
  • Organizer: 令和3年 (2021年) 度 日本結晶学会年会
• [Presentation] Two tales of Diels-Alderases: How decalin skeletons are stereo-selectively constructed (2021)
  • Author(s): 〇Shingo Nagano
  • Organizer: RIKEN CSRS Seminar
  • Invited
• [Presentation] 立体選択性が異なるディールスアルダー反応をおこなう 酵素Phm7とFsa2の分子機構 (2021)
  • Author(s): 〇永野真吾
  • Organizer: 第54回酸化反応討論会
  • Invited
• [Presentation] 〇永野真吾 (2021)
  • Author(s): 立体選択性が異なる 2 種類の Diels－Alder 反応酵素がデカリン骨格を構築する分子メカニズム
  • Organizer: 令和三年度 新学術領域研究「高速分子動画」シンポジウム・領域会議
• [Presentation] 天然物生合成酵素の構造生物学 (2021)
  • Author(s): 〇永野真吾
  • Organizer: 日本薬物動態学会第36回年会
  • Invited
• [Presentation] 植物ステロイド化合物の生合成と代謝の構造生物学 (2021)
  • Author(s): 〇永野真吾
  • Organizer: 日本薬学会第142年会（名古屋）[S06] 薬用植物化学研究の新展開
  • Invited
• [Presentation] X線自由電子レーザー施設 SACLA で何ができるか？ (2021)
  • Author(s): ○中津 亨
  • Organizer: 日本薬学会 第141年会
• [Presentation] カルシウム結合型発光タンパク質イクオリンには過酸化状態が存在する (2021)
  • Author(s): ○船橋 俊也、南後 恵理子、岩田 想、加藤 博章、中津 亨
  • Organizer: 日本薬学会 第141年会
• [Presentation] Candida albicansの多剤排出型ABCトランスポーターCdr1pの精製と機能解析 (2021)
  • Author(s): ○筒井 隼一、陳 月、中津 亨、加藤 博章、潘 東青
  • Organizer: 日本薬学会 第141年会
• [Presentation] 多剤排出トランスポーターCmABCB1と基質アナログの結晶構造解析 (2021)
  • Author(s): ○水沼 諒、小田島 圭、三和 空知、潘 東青、瀧川 紘、中津 亨、高須 清誠、加藤 博章
  • Organizer: 日本薬学会 第141年会
• [Presentation] ABCトランスポーターの開閉機構 (2021)
  • Author(s): ○中津 亨
  • Organizer: 第42回生体膜と薬物の相互作用シンポジウム
  • Invited
• [Presentation] カルシウム結合による発光タンパク質イクオリンの初期構造変化 (2021)
  • Author(s): ○中津 亨
  • Organizer: 令和3年度高速分子動画シンポジウム
• [Presentation] はじめに:生体分子の高速分子動画撮影 (2021)
  • Author(s): ○中津 亨
  • Organizer: 第93回日本生化学会大会
• [Presentation] SACLAにおけるタンパク質X線結晶構造解析の現状 (2021)
  • Author(s): ○中津 亨
  • Organizer: 第49回構造活性相関シンポジウム
  • Invited
• [Presentation] 野生種トマトにおけるトマチン代謝の初発反応を触媒する2-オキソグルタル酸依存性ジオキシゲナーゼの精製と結晶化 (2020)
  • Author(s): 〇宮﨑麻紗美、藤山敬介、日野智也、水谷正治、永野真吾
  • Organizer: 第93回日本生化学会大会
• [Presentation] トマチン16位水酸化酵素と20位脱水素酵素のX線結晶構造解析 (2020)
  • Author(s): ◯宮﨑麻紗美、藤山敬介、日野智也、水谷正治、秋山遼太、加藤純平、永野真吾
  • Organizer: 日本結晶学会 令和2年(2020年)度年会
• [Presentation] 銅含有亜硝酸還元酵素の動的結晶構造解析 (2020)
  • Author(s): ◯溝端栄一
  • Organizer: 第93会日本生化学会大会, 「高速分子動画」共催シンポジウム, タンパク質の高速分子動画撮影の汎用化に向けて
• [Presentation] CO2固定酵素RuBisCOの分子動画撮影に向けた結晶調製 (2020)
  • Author(s): ◯清田雄大、熊野翔太、溝端栄一
  • Organizer: 令和二年度 新学術領域研究「高速分子動画」シンポジウム
• [Presentation] 高活性型ブラシノステロイドを生産するCYP85A3の構造決定に向けた大量発現及び精製 (2020)
  • Author(s): 藤山 敬介, 高見祐貴, 日野 智也, 大西利幸, 轟泰司, 水谷 正治, 永野 真吾
  • Organizer: 日本農芸化学会2020年度大会（誌上開催）
• [Presentation] ラダラン脂質生合成の推定鍵酵素コバラミン依存性ラジカルSAM酵素のホロ型発現系の構築 (2020)
  • Author(s): 美馬正弥、末宗周憲、日野智也、永野真吾
  • Organizer: 日本農芸化学会2020年度大会（誌上開催）
• [Presentation] 好熱性P糖タンパク質CmABCB1における膜貫通第４ヘリックス（TM4）の役割 (2020)
  • Author(s): 水沼 諒、井上 善貴、松岡 敬太、潘 東青、中津 亨、加藤 博章
  • Organizer: 日本薬学会第140年会
• [Presentation] P糖タンパク質CmABCB1の輸送基質としてのローダミン誘導体の構造活性相関研究 (2020)
  • Author(s): 瀧川紘、三和空知、山岡庸介、山口知宏、中津亨、加藤博章、高須清誠
  • Organizer: 日本薬学会第140年会
• [Presentation] 多剤排出ABCトランスポーターによる基質排出機構の解明 (2020)
  • Author(s): 松岡敬太, 小段篤史, 山口知宏, 中津亨, 木村泰久, 植田和光, 加藤博章
  • Organizer: 医薬系研究交流サロン
• [Presentation] Crystal structures of CYP90B1, a key enzyme in brassinosteroid biosynthesis (2019)
  • Author(s): Keisuke Fujiyama, Tomoya Hino, Hyoung Jae Lee, Masaharu Mizutani, Shingo Nagano
  • Organizer: 23rd International Conference on Cytochrome P450: Biochemistry and Biophysics
  • Int'l Joint Research / Invited
• [Presentation] ラダラン脂質の梯子状疎水基を構築すると推定されているラジカルSAM酵素の補因子の再構成 (2019)
  • Author(s): 美馬正弥、末宗周憲、日野智也、高井研、永野真吾
  • Organizer: 第92回日本生化学会大会
• [Presentation] ラダラン脂質生合成アシルACP中間体の探索に向けた抗ACP抗体の作製 (2019)
  • Author(s): 上垣哲心、末宗周憲、日野智也、永野真吾
  • Organizer: 第92回日本生化学会大会
• [Presentation] 酵素反応の高速分子動画撮影へのチャレンジ (2019)
  • Author(s): 永野真吾
  • Organizer: 令和元年度新学術領域研究「高速分子動画」キックオフミーティング・膜タンパク質研究会
• [Presentation] 分子内ディールスアルダー反応を触媒する酵素Phm7の結晶構造 (2019)
  • Author(s): 藤山敬介，加藤直樹，日野智也，高橋俊二，永野真吾
  • Organizer: 令和元年度新学術領域研究「高速分子動画」キックオフミーティング・膜タンパク質研究会
• [Presentation] トマチン16位水酸化酵素のX線結晶構造解析 (2019)
  • Author(s): 安田早希、藤山敬介、日野智也、水谷正治、永野真吾
  • Organizer: 令和元年度結晶学会
• [Presentation] 結晶構造に基づいたCYP90B1によるステロールC-22位水酸化の立体選択性の改変 (2019)
  • Author(s): 藤山 敬介, 畑田 珠希, 日野 智也, 水谷 正治, 永野 真吾
  • Organizer: 植物化学調節学会第54回大会
• [Presentation] Synthesis and structure_ATPase activity relationship of rhodamine derivatives against Pglycoprotein CmABCB1 (2019)
  • Author(s): Hiroshi Takikawa, Sorachi Miwa, Rina Takeuchi, Yousuke Yamaoka, Tomohiro Yamaguchi, Toru Nakatsu, Hiroaki Kato and Kiyosei Takasu
  • Organizer: 27th International Society of Heterocyclic Chemistry Congress
• [Presentation] Mechanism of coupling between extracellular gate opening and ATP hydrolysis in P-glycoprotein, CmABCB1. (2019)
  • Author(s): Keita Matsuoka, Toru Nakatsu, Hiroaki Kato
  • Organizer: Seoul-Kyoto-Osaka_Joint Symposium on Pharmaceutical Sciences_for Young_Scientists
• [Presentation] X線自由電子レーザーを応用したタンパク質の動的結晶構造解析 (2019)
  • Author(s): 溝端栄一
  • Organizer: 日本プロテオーム学会2019年大会 第70回日本電気泳動学会総会
  • Invited
• [Presentation] X線自由電子レーザーを利用したタンパク質の動的構造解析 (2019)
  • Author(s): 溝端栄一
  • Organizer: 文部科学省学術調査官特別会議
• [Presentation] Rubiscoの分子動画撮影に向けた戦略 (2019)
  • Author(s): 溝端栄一
  • Organizer: 第１回 高速分子動画のための光化学制御研究会
• [Presentation] CO2固定酵素Rubiscoの分子動画撮影に向けた研究 (2019)
  • Author(s): 清田雄大、溝端栄一
  • Organizer: 令和元年度新学術領域研究「高速分子動画」キックオフミーティング・膜タンパク質研究会
• [Book] 膜タンパク質工学ハンドブック 『構造・解析―X線自由電子レーザーによる膜タンパク質の構造解析』 (2020)
  • Author(s): 溝端栄一、久保稔
  • Total Pages: 5
  • Publisher: (株)エヌ・ティー・エス
• [Book] 膜タンパク質工学ハンドブック 『X線結晶解析による新規構造の解明』 (2020)
  • Author(s): 山下恵太郎、溝端栄一
  • Total Pages: 7
  • Publisher: (株)エヌ・ティー・エス
• [Remarks] 天然物が持つ鏡像異性な環状骨格を作り分ける 2つの酵素の反応機構を解明
  • URL: https://www.tottori-u.ac.jp/item/18745.htm
• [Remarks] 天然物が持つ鏡像異性な環状骨格を作り分ける2つの酵素の反応機構を解明（プレスリリース）
  • URL: http://www.spring8.or.jp/ja/news_publications/press_release/2021/210819_2/
• [Remarks] ディールス・アルダー反応を触媒する酵素の合理的デザインに向けて
  • URL: https://www.setsunan.ac.jp/files/no2111.pdf
• [Remarks] 天然物が持つ鏡像異性な環状骨格を作り分ける2つの酵素の反応機構を解明
  • URL: https://www.amed.go.jp/news/seika/kenkyu/20210819-01.html