Development of fixed target micro-crystallography dedicated to structural dynamics study

• Project Area: Non-equilibrium-state molecular movies and their applications
• Project/Area Number: 19H05783
• Research Category: Grant-in-Aid for Scientific Research on Innovative Areas (Research in a proposed research area)
• Allocation Type: Single-year Grants
• Review Section: Complex systems
• Research Institution: Institute of Physical and Chemical Research
• Principal Investigator: 山本 雅貴 国立研究開発法人理化学研究所, 放射光科学研究センター, 部門長 (60241254)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 熊坂 崇 公益財団法人高輝度光科学研究センター, 構造生物学推進室, 室長 (30291066)
• Project Period (FY): 2019-06-28 – 2024-03-31
• Project Status: Granted (Fiscal Year 2023)
• Budget Amount: ¥100,880,000 (Direct Cost: ¥77,600,000、Indirect Cost: ¥23,280,000); Fiscal Year 2023: ¥15,860,000 (Direct Cost: ¥12,200,000、Indirect Cost: ¥3,660,000); Fiscal Year 2022: ¥16,380,000 (Direct Cost: ¥12,600,000、Indirect Cost: ¥3,780,000); Fiscal Year 2021: ¥16,380,000 (Direct Cost: ¥12,600,000、Indirect Cost: ¥3,780,000); Fiscal Year 2020: ¥22,490,000 (Direct Cost: ¥17,300,000、Indirect Cost: ¥5,190,000); Fiscal Year 2019: ¥29,770,000 (Direct Cost: ¥22,900,000、Indirect Cost: ¥6,870,000)
• Keywords: X線結晶構造解析 / 構造ダイナミクス / 放射光 / In-situ測定 / 微小結晶構造解析 / 室温構造解析

Outline of Research at the Start

生命科学や創薬科学にとって重要なタンパク質の構造ダイナミクス研究の振興を目指して、動的Ｘ線結晶構造解析の汎用化に貢献する「固定ターゲットによる高効率高精度X線回折データ収集技術」と「In-situ測定用試料雰囲気制御技術」を研究開発する。
固定ターゲットX線回折データ収集技術では、動的Ｘ線結晶構造解析成功の鍵といえる「微小結晶の微弱な回折強度の正確な測定」に適した真空回折計を開発する。また、in-situ測定用試料雰囲気制御技術では、これまで開発してきた試料雰囲気制御装置の温度制御範囲拡大等の高度化を実施する。最終的に、二つの技術を融合して動的Ｘ線結晶構造解析の高度化に貢献する。

Outline of Annual Research Achievements

真空カメラおよびin-situ測定系について、開発した装置のさらなる高度化を進めた。
真空カメラ：前年度の実験において、減圧下で顕在化する微弱かつ非対称なバックグラウンド散乱があることを確認し、大気圧下に加えて、減圧下でも光学調整が必要であることが判明した。減圧下でのビーム調整手法の確立を目指した本年度前期のビームタイムで、バックグラウンド散乱強度が等方的になるまで大気圧下で光学調整を行なった後、カプトンフィルムを窓材とするX線取出し窓を取り付け減圧を開始したところカプトンフィルムが破断し、急激な大気流入により真空槽内に設置したゴニオメーター等の機器が破損した。修理のため、2022年度内に減圧下での光学調整法の検討は実施できなかった。回折計の修理に当って、X線取出し窓の窓材をカーボンファイバー膜とカプトンフィルムを一体成形した素材に変更してX線取出し窓を高強度化した。また、ビームストップ位置調整用の水平軸に用いている直線導入機の位置制度及び再現性向上のための補強など真空カメラの改良を実施した。
In-situ測定用試料雰囲気制御の開発を中心に実施した。試料環境雰囲気制御に用いる装置の高温対応について、70℃まで対応した装置の評価データの取得と安定性の改良を進めた。微小結晶SS-ROX法によるタイムスライス高速データ測定法の開発では、2インジェクターをベースとした試料導入法を整備した。HAG法に適した結晶化方法開発では、これまで設計した多量体形成ペプチドを目的酵素のN/C両末端に接続し人工蛋白質を調製、活性のある集合体を作成、変異により集合度の調節も実現した。

Current Status of Research Progress

3: Progress in research has been slightly delayed.

Reason

真空回折計の開発においては、実験時にX線取り出し口となるカプトン窓の破損により回折計が故障したため、真空下での光学調整によるバックグラウンド散乱の低減と低分子試料を用いた評価を進められなかった。一方で、回折計の修理に伴い、ビームストップ水平軸に利用している直線導入機の補強、鉛直方向のアクチュエータ制御への切り替え、より高い強度が期待されるカーボンファイバー積層カプトン窓への移行等を実施した。またカプトン窓の真空耐久試験用治具を作製した。試料調製では、公募班と協力したSiN薄膜の大型化、結晶試料を高密度にグリッド上に展開する条件検討を進めた。
in-situ測定系の設計製作では、安定に20-70℃の温度範囲での調湿操作が可能となり、ソーマチン結晶を用いた評価実験では、昇温と調湿を組み合わせた回折実験を行い可逆的な相転移の誘導が確認できた。現在、論文発表に向けた準備を進めている。微小結晶を用いたタイムスライス高速データ測定法の開発では、SACLAで使用実績のある高粘度媒体インジェクターを導入した。放射光ビームラインにおけるミリ秒オーダーの測定では、SACLAでは問題にならない媒体の振動の影響が回折像に現れた。そこで、シースガスや媒体の吸引をなくし、長時間安定に試料を流し続けるための条件を確立した。結晶化法については、これまで設計した多量体形成(3-6量体および2量体)ペプチドを目的酵素のN/C両末端に接続し人工蛋白質を調製、これに酵素活性が存在することを確認した。アフィニティタグのプロテアーゼ切断により会合が開始するが、切断後の濁度と粒径の上昇を実験で確認した。また電荷会合度の異なる変異体を作成、分子会合の評価を進めた。一方、新たなペプチド会合体の設計基盤となる4量体3種類の結晶構造を得た。
真空回折計の評価実験に遅れは出ているものの、その他の項目は順調に推移している。

Strategy for Future Research Activity

真空カメラについては、前年度までに洗い出した課題をもとにバックグラウンド散乱の低減に向けた検討を進める。さらに、大気下および真空下において低分子標準試料を用いた評価実験を実施する。回折計本体の修理と並行して行った改良により、ビームストップの位置精度や移動に伴う位置再現性の改善が期待できる。真空下での光学調整により、バックグラウンド散乱の異方性を解消し、等方的な極低バックグラウンド散乱を実現する。その設定において、真空下および大気下における標準試料シチジンの回折データ収集を行い、極低バックグランド測定に起因するデータ処理、構造解析への影響を調査する。また、公募班と協力して試料グリッドのSiN窓大型化を行い、データ取得効率を向上させるとともに、生体高分子の微小結晶試料における回折データ取得、構造解析を目指す。
高温対応調温調湿装置については放射光ビームラインへの設置および動作試験、試験測定を行いつつ、20－70℃昇温測定法の開発と論文発表の準備を進めると共に、実験機会を提供する。rtHAG法とSS-ROX法を組み合わせた微小結晶の室温測定法については、タイムスライス高速データ測定法の開発のため、試料の状態を評価するオンライン顕微分光装置をBL41XUに導入すると共に、光励起用ナノ秒OPOレーザー光学系を構築し、利用を開始する。インジェクターを用いたシリアル法については、励起レーザー光学系とタイミング制御系を構築し、光受容タンパク質の時分割構造解析を進める。これらの実験環境は、領域内研究者を中心に実験機会の提供を進めていく。また、HAG法に適した結晶化法の開発では、会合性タグを両端および片側のみに付与したものを調製し、結晶化への効果を評価する。さらに、これまでに設計した複数のタグを用いた分子種を調製し、種々の分析法で評価を行い、結晶化に向けた設計をさらに進める。

Research Products

• [Int'l Joint Research] University of Liverpool(英国)
• [Journal Article] Room Temperature Serial Synchrotron Crystallography (2022)
  • Author(s): HASEGAWA Kazuya、KUMASAKA Takashi
  • Journal Title: Nihon Kessho Gakkaishi Volume: 64 Issue: 4 Pages: 294-299
  • DOI: 10.5940/jcrsj.64.294
  • ISSN: 0369-4585, 1884-5576
  • Year and Date: 2022-12-15
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] X-ray Crystallographic Analysis of Copper Amine Oxidase in Physiological Environments using Humid Air and Glue-coating（HAG）Method (2022)
  • Author(s): BABA Seiki、MURAKAWA Takeshi
  • Journal Title: Nihon Kessho Gakkaishi Volume: 64 Issue: 4 Pages: 285-289
  • DOI: 10.5940/jcrsj.64.285
  • ISSN: 0369-4585, 1884-5576
  • Year and Date: 2022-12-15
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] Macromolecular Crystallography at SPring-8 (2022)
  • Author(s): YAMAMOTO Masaki、HIRATA Kunio、HASEGAWA Kazuya
  • Journal Title: Nihon Kessho Gakkaishi Volume: 64 Issue: 1 Pages: 2-9
  • DOI: 10.5940/jcrsj.64.2
  • ISSN: 0369-4585, 1884-5576
  • Year and Date: 2022-02-28
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] Single crystal spectroscopy and multiple structures from one crystal (MSOX) define catalysis in copper nitrite reductases (2022)
  • Author(s): Rose Samuel L.、Baba Seiki、Okumura Hideo、Antonyuk Svetlana V.、Sasaki Daisuke、Hedison Tobias M.、Shanmugam Muralidharan、Heyes Derren J.、Scrutton Nigel S.、Kumasaka Takashi、Tosha Takehiko、Eady Robert R.、Yamamoto Masaki、Hasnain S. Samar
  • Journal Title: Proceedings of the National Academy of Sciences Volume: 119 Issue: 30
  • DOI: 10.1073/pnas.2205664119
  • Peer Reviewed / Open Access / Int'l Joint Research
• [Journal Article] Elucidating polymorphs of crystal structures with intensity-based hierarchical clustering analysis on multiple diffraction datasets (2022)
  • Author(s): Matsuura Hiroaki、Sakai Naoki、Toma-Fukai Sachiko、Muraki Norifumi、Hayama Koki、Kamikubo Hironari、Aono Shigetoshi、Kawano Yoshiaki、Yamamoto Masaki、Hirata Kunio
  • Journal Title: bioRxiv Volume: X
  • DOI: 10.1101/2022.09.13.507775
  • Open Access
• [Journal Article] New Applications of the High-Throughput Data Collection System at SPring-8 Macromolecular Crystallography Beamlines (2021)
  • Author(s): MATSUURA Hiroaki、SAKAI Naoki
  • Journal Title: Nihon Kessho Gakkaishi Volume: 63 Issue: 3 Pages: 219-221
  • DOI: 10.5940/jcrsj.63.219
  • NAID: 130008083578
  • ISSN: 0369-4585, 1884-5576
  • Year and Date: 2021-08-31
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] Automatic Data Collection and Remote-Measurement Systems at SPring-8 MX Beamlines (2021)
  • Author(s): BABA Seiki、MIZUNO Nobuhiro
  • Journal Title: Nihon Kessho Gakkaishi Volume: 63 Issue: 3 Pages: 216-218
  • DOI: 10.5940/jcrsj.63.216
  • NAID: 130008083579
  • ISSN: 0369-4585, 1884-5576
  • Year and Date: 2021-08-31
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] Common architectures in cyanobacteria Prochlorococcus cells visualized by X-ray diffraction imaging using X-ray free electron laser (2021)
  • Author(s): Kobayashi Amane、Takayama Yuki、Hirakawa Takeshi、Okajima Koji、Oide Mao、Oroguchi Tomotaka、Inui Yayoi、Yamamoto Masaki、Matsunaga Sachihiro、Nakasako Masayoshi
  • Journal Title: Scientific Reports Volume: 11 Issue: 1 Pages: 3877-3877
  • DOI: 10.1038/s41598-021-83401-y
  • Peer Reviewed / Open Access / Int'l Joint Research
• [Journal Article] Evaluation of the data-collection strategy for room-temperature micro-crystallography studied by serial synchrotron rotation crystallography combined with the humid air and glue-coating method (2021)
  • Author(s): Hasegawa Kazuya、Baba Seiki、Kawamura Takashi、Yamamoto Masaki、Kumasaka Takashi
  • Journal Title: Acta Crystallographica Section D Structural Biology Volume: 77 Issue: 3 Pages: 300-312
  • DOI: 10.1107/s2059798321001686
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] A temperature-controlled cold-gas humidifier and its application to protein crystals with the humid-air and glue-coating method (2019)
  • Author(s): Baba Seiki、Shimada Atsuhiro、Mizuno Nobuhiro、Baba Junpei、Ago Hideo、Yamamoto Masaki、Kumasaka Takashi
  • Journal Title: Journal of Applied Crystallography Volume: 52 Issue: 4 Pages: 699-705
  • DOI: 10.1107/s1600576719006435
  • Peer Reviewed / Open Access / Int'l Joint Research
• [Presentation] 多数の結晶を利用したタンパク質の構造多型解析 (2023)
  • Author(s): 松浦滉明, 平田邦生, 坂井直樹, 河野能顕, 山本雅貴
  • Organizer: 第36回日本放射光学会年会
• [Presentation] タンパク質結晶解析ビームラインBL41XUの現状と高度化 (2023)
  • Author(s): 馬場清喜, 長谷川和也, 村上博則, 増永拓也, 重松秀樹, 加藤公児, 奥村英夫, 水野伸宏, 仲村勇樹, 坂井直樹, 河村高志, 平田邦生, 上野剛, 山本雅貴, 熊坂崇
  • Organizer: 第36回日本放射光学会年会
• [Presentation] HAG法を用いたタンパク質結晶顕微分光測定システム (2023)
  • Author(s): 馬場清喜, 村川武志, 河村高志, 入江崇起, 河野能顕, 奥村英夫, 水野伸宏, 長谷川和也, 山本雅貴, 熊坂崇
  • Organizer: 第36回日本放射光学会年会
• [Presentation] 構造ダイナミクス解明に向けたX線結晶構造解析の新たな展開 (2023)
  • Author(s): 松浦滉明
  • Organizer: 遺伝研研究会「単細胞生物に見られる生体プロセスの恒常性維持システム」
  • Invited
• [Presentation] Development of in-vacuum diffractometer for micro-crystallography at SPring-8 (2022)
  • Author(s): Matsuura Hiroaki, Ago Hideo, Hirata Kunio, Ueno Go, Suzuki Akihiro, Yamamoto Masaki
  • Organizer: Molecular Movie International Symposium 2022
  • Int'l Joint Research
• [Presentation] SPring-8 MX-BLにおける自動化技術と高輝度微小ビームを駆使した構造多様性解析 (2022)
  • Author(s): 松浦滉明, 平田邦生, 坂井直樹, 竹下浩平, 當舎武彦, 河野能顕, 山本雅貴
  • Organizer: 第22回日本蛋白質科学会年会
• [Presentation] 時分割構造解析に向けたSPring-8 BL41UXの高度化 (2022)
  • Author(s): 長谷川和也, 馬場清喜, 河村高志, 村上博則, 増永拓也, 山本雅貴, 熊坂崇
  • Organizer: 第22回日本蛋白質科学会年会
• [Presentation] タンパク質の作用機序解明に迫る結晶構造解析の新たな展開 (2022)
  • Author(s): 松浦滉明, 平田邦生, 坂井直樹, 河野能顕, 山本雅貴
  • Organizer: 第48回生体分子科学討論会
• [Presentation] 共用ビームラインの現状報告 (2022)
  • Author(s): 馬場清喜
  • Organizer: 蛋白研セミナー：第81 回SPring-8 先端利用技術ワークショップ
• [Presentation] JASRI 構造生物学推進室 測定技術開発チーム (2022)
  • Author(s): 長谷川和也, 馬場清喜, 水野伸宏, 奥村英夫, 村上博則, 増永拓也, 八木直人, 熊坂崇
  • Organizer: SPring-8シンポジウム2022
• [Presentation] Serial Synchrotron Crystallography at SPring-8 (2022)
  • Author(s): Hasegawa Kazuya
  • Organizer: Asia-Oceania Conference on Synchrotron Radiation Instruments 2022
  • Int'l Joint Research / Invited
• [Presentation] 酵素反応機構の解明に迫るX線結晶構造解析法の新展開 (2022)
  • Author(s): 松浦滉明
  • Organizer: 第95回日本生化学会大会
  • Invited
• [Presentation] SPring-8を用いたシリアル結晶構造解析 (2022)
  • Author(s): 長谷川和也
  • Organizer: 令和4年度 新学術領域研究「高速分子動画」シンポジウム
• [Presentation] 回折データの分類によるXRDベースの構造多型解析 (2022)
  • Author(s): 松浦滉明, 平田邦生, 中山楓, 坂井直樹, 河野能顕, 山本雅貴
  • Organizer: 令和４年度新学術領域研究「高速分子動画」シンポジウム
• [Presentation] 階層的クラスタリングを用いた構造多型解析の現状 (2022)
  • Author(s): 松浦滉明, 平田邦生, 坂井直樹, 河野能顕, 山本雅貴
  • Organizer: 令和４年度日本結晶学会年会
• [Presentation] HAG法を用いた非凍結タンパク質結晶顕微分光測定システムの開発 (2022)
  • Author(s): 馬場清喜, 村川武志, 河村高志, 入江崇起, 河野能顕, 奥村英夫, 水野伸宏, 長谷川和也, 山本雅貴, 熊坂崇
  • Organizer: 令和４年度日本結晶学会年会
• [Presentation] SPring-8 BL41XUにおける常温回折測定環境の開発 (2022)
  • Author(s): 奥村英夫, 馬場清喜, 長谷川和也, 河村高志, 村上博則, 増永拓也, 山本雅貴, 熊坂崇
  • Organizer: 令和４年度日本結晶学会年会
• [Presentation] 動的構造解析に向けたSPring-8 BL41XUの高度化構想 (2022)
  • Author(s): 長谷川和也, 馬場清喜, 河村高志, 村上博則, 増永拓也, 山本雅貴, 熊坂崇
  • Organizer: 第35回日本放射光学会年会・放射光科学合同シンポジウム
• [Presentation] 階層的クラスタリングを用いた回折データの分類と構造多型の解析 (2021)
  • Author(s): 松浦滉明, 平田邦生, 坂井直樹, 河野能顕, 山本雅貴
  • Organizer: 第21回日本蛋白質科学会年会
• [Presentation] タンパク質結晶回折ビームラインの現状と今後 (2021)
  • Author(s): 長谷川和也, 馬場清喜, 水野伸宏, 奥村英夫, 河村高志, 村上博則, 仲村勇樹, 増永拓也,小倉章衣, Marcel Bokhove, 堀坂恵美, 石原知子, 八木直人, 熊坂崇
  • Organizer: SPring-8シンポジウム
• [Presentation] 共用ビームラインの現状報告 (2021)
  • Author(s): 長谷川和也
  • Organizer: SPring-8 先端利用技術ワークショップ / 蛋白研セミナー
• [Presentation] 階層的クラスタリングを用いた回折データ分類による構造多様性解析法の検討 (2021)
  • Author(s): 松浦滉明
  • Organizer: 高速分子動画シンポジウム
• [Presentation] サブミクロン結晶からの構造決定を目指した微小結晶解析基盤の開発 (2021)
  • Author(s): 松浦滉明、小林周、鈴木明大、平田邦生、上野剛、吾郷日出夫、山本雅貴
  • Organizer: 高速分子動画シンポジウム
• [Presentation] 構造多型解析に向けた回折データ分類の検討 (2021)
  • Author(s): 松浦滉明, 坂井直樹, 平田邦生, 河野能顕, 山本雅貴
  • Organizer: 日本結晶学会令和３年度年会
• [Presentation] A new trend of protein crystallography: polymorph analysis using hierarchical clustering of diffraction data (2021)
  • Author(s): Hiroaki Matsuura, Kunio Hirata, Naoki Sakai, Yoshiaki Kawano, Masaki Yamamoto
  • Organizer: PDB 50th Anniversary Symposium in Asia
  • Int'l Joint Research
• [Presentation] 時分割構造解析に向けたSPring-8 BL41XUの高度化構想 (2021)
  • Author(s): 長谷川和也, 馬場清喜, 河村高志, 村上博則, 増永拓也, 山本雅貴, 熊坂崇
  • Organizer: 日本結晶学会年会
• [Presentation] 理研構造ゲノムビームラインI & IIの現状 (2021)
  • Author(s): 上野剛，奥村英夫，伊藤翔，仲村勇樹, 馬場清喜，村上博則，平田邦生，河野能顕，引間孝明, 増永拓也，水野伸宏，河村高志，長谷川和也，熊坂崇，山本雅貴
  • Organizer: 第34回日本放射光学会年会・放射光科学合同シンポジウム
• [Presentation] SPring-8共用タンパク質結晶解析ビームラインの現状 (2021)
  • Author(s): 奥村英夫,長谷川和也, 馬場清喜, 水野伸宏, 河村高志, 村上博則, 仲村勇樹, 増永拓也, 平田邦生, 坂井直樹, 上野剛, 山本雅貴, 熊坂崇
  • Organizer: 第34回日本放射光学会年会・放射光科学合同シンポジウム
• [Presentation] SPring-8共用タンパク質結晶回折ビームラインの現状 (2020)
  • Author(s): 馬場清喜, 長谷川和也, 水野伸宏, 奥村英夫, 河村高志, 村上博則, 仲村勇樹, 増永拓也, 熊坂崇
  • Organizer: 日本結晶学会2020年度年会
• [Presentation] 室温での結晶回折実験～開発と利用 (2020)
  • Author(s): 熊坂崇
  • Organizer: 令和二年度新学術領域研究「高速分子動画」シンポジウム
• [Presentation] SPring-8 PX-BL 自動測定・遠隔測定の現状 (2020)
  • Author(s): 熊坂崇
  • Organizer: SPring-8シンポジウム2020
  • Invited
• [Presentation] SPring-8におけるシリアル放射光結晶解析法の開発 (2020)
  • Author(s): 熊坂崇
  • Organizer: 第58回日本生物物理学会年会
• [Presentation] Fixed-target serial synchrotron crystallography combined with HAG method for room temperature measurement (2019)
  • Author(s): Kumasaka T, Hasegawa K, Baba S, Kawamura T, Yamashita K, Hirata K, Yamamoto M.
  • Organizer: ACA2019
• [Presentation] Room temperature fixed target serial synchrotron rotation crystallography combined with HAG method. (2019)
  • Author(s): Hasegawa K, Baba S, Kawamura T, Yamashita K, Hirata K, Yamamoto M, Kumasaka T
  • Organizer: ISDSB 2019
  • Int'l Joint Research
• [Presentation] 調温 HAG 法によるタンパク質非凍結結晶構造解析の現状 (2019)
  • Author(s): 馬場清喜・村川武志・水野伸宏・奥村英夫・熊坂崇
  • Organizer: 日本結晶学会令和元年度年会
• [Presentation] SPring-8 共用タンパク質結晶回折ビームラインの現状 (2019)
  • Author(s): 水野伸宏・長谷川和也・馬場清喜・奥村英夫・河村高志・中林誠・村上博則・仲村勇樹・増永拓也・熊坂崇
  • Organizer: 日本結晶学会令和元年度年会
• [Presentation] 構造に基づくヘテロ4量体コイルドコイルペプチドの設計 (2019)
  • Author(s): 大塚裕貴・尾崎愛美・中林誠・河村高志・水野伸宏・仲村勇樹・長谷川和也・山口宏・熊坂崇
  • Organizer: 日本結晶学会令和元年度年会
• [Book] 生体高分子結晶のX線構造解析―実践手法と基礎理論― (2022)
  • Author(s): 竹中章郎, 熊坂崇, 近藤次郎, 角南智子, 茶竹俊行, 森下えら
  • Total Pages: 332
  • Publisher: 丸善出版
  • ISBN: 4621307061