新規Disome-Seq法: パラメトリックなリボソーム渋滞の網羅的探索

• Project Area: Parametric biology based on translation rate regulatory mechanism
• Project/Area Number: 20H05784
• Research Category: Grant-in-Aid for Transformative Research Areas (B)
• Allocation Type: Single-year Grants
• Review Section: Transformative Research Areas, Section (III)
• Research Institution: Institute of Physical and Chemical Research
• Principal Investigator: 岩崎 信太郎 国立研究開発法人理化学研究所, 開拓研究本部, 主任研究員 (80611441)
• Project Period (FY): 2020-10-02 – 2023-03-31
• Project Status: Granted (Fiscal Year 2022)
• Budget Amount: ¥38,220,000 (Direct Cost: ¥29,400,000、Indirect Cost: ¥8,820,000); Fiscal Year 2022: ¥11,310,000 (Direct Cost: ¥8,700,000、Indirect Cost: ¥2,610,000); Fiscal Year 2021: ¥12,350,000 (Direct Cost: ¥9,500,000、Indirect Cost: ¥2,850,000); Fiscal Year 2020: ¥14,560,000 (Direct Cost: ¥11,200,000、Indirect Cost: ¥3,360,000)
• Keywords: 翻訳 / Ribosome / Ribosome profiling / Disome / Disome-Seq

Outline of Research at the Start

リボソームがコドンを読み取る速度は一定ではなく、むしろパラメトリックに進行し、一時停止および渋滞をする例があることが報告されている。しかしながらその全容や速度制限にかかわる共通の原理・ルールは全く明らかにされていない。これはリボソーム一時停止を網羅的に、かつ高感度に探索する技術がこれまで皆無であったことによる。本研究ではこの問題を解決する『Disome-Seq法』と呼ばれる新規技術を確立し、リボソーム一時停止を探索するとともに、班員が得意とする物理化学的な影響 (原田・岡部)あるいは高次生命現象 (土居、池内)でどのように制御されるかを理解することを目指す。

Outline of Annual Research Achievements

分子生物学のセントラルドグマは遺伝情報である核酸の情報をアミノ酸という性質の異なる分子配列へ変換する仕組みであるが、その変換速度の鍵を握るのがリボソームが行う翻訳である。リボソームによるコドンの読み取り速度は一般に一定であると考えられがちである。しかし、実は多様な原因によって一時停止するという非常にパラメトリックな動態を示す。これまでにribosomeの停止位置を網羅的・定量的・高感度に検出する手法としてDisome-Seq法を開発してきた。この技術は、渋滞したリボソームがDisome (di-ribosome)を形成することを利用し、リボソーム2つ分の長さのRNaseフットプリントを回収し、次世代シーケンサーによって読み取る手法である (Han et al. Cell Rep 2020)。この手法の確立により、リボソーム一時停止が生じやすいコドンやアミノ酸配列のcontextが明らかになった。それぞれリボソームの伸長反応、終結反応、リサイクリング反応が遅れるような状況でリボソーム渋滞が生じる。また、ゼブラフィッシュとヒト細胞の比較により、進化的保存性も明らかになった。
また、Ribosome一つ分のフットプリントを扱うstandard Ribo-Seq法と合わせ、これまで翻訳を網羅的に解析し、そのパラメトリック制御を明らかにしてきた。例えば、翻訳阻害剤rocaglamide A (Chen et al. Cell Chem Biol 2021)やスプライシング調節剤 (Yoshimoto et al. Cell Chem Biol 2021)による翻訳制御機構を明らかにした。また、その手法の詳細をprotocol論文として発表し (Mito et al. STAR Protoc 2020)、領域内の共同研究の促進のための礎とした。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

細胞の中ではリボソーム一時停止は積極的解消されると考えられている。これまでに、リボソーム一時停止を解消することが示唆されている因子ABCE1、 ASCC3、 ZNF598、eIF5A、PELO、GCN2等があげられるがその特異性についてはよくわかっていない。そこでsiRNAなどによりそれぞれの因子ノックダウンし、Disome-Seqを行うことで、それぞれの因子によって解消されているリボソーム一時停止の違いに関して検証した。その結果、各因子をノックダウンしたときに生じるdisome位置はそれぞれ大きく異なり、それぞれの因子が対象とするリボソーム一時停止には明確な違いがあることがわかってきた。例えば、ABCE1によって解消されるリボソーム一時停止はNMD標的mRNAのstopコドン上のものであることが明らかになってきた。現在さらに詳細に解析を進め、その特異性の理解を目指している。

Strategy for Future Research Activity

上記のように、因子間で解消の対象としているリボソーム一時停止が異なることが明らかになってきた。その一方で、それぞれが同一の経路で機能しうるのか、相補性はあるのか、といったことが疑問になってくる。たとえば一方の因子がなくなった場合に生じるリボソーム一時停止は、もう一方の因子で解消されうるのか、といったことである。この点を理解するために、上記の因子２つを同時にノックダウンしDisome-Seqを行う予定である。

Research Products

• [Int'l Joint Research] University of California, Berkeley/University of California, San Francisco(米国)
• [Journal Article] The Pentatricopeptide Repeat Protein PGR3 Is Required for the Translation of petL and ndhG by Binding Their 5′ UTRs (2021)
  • Author(s): Higashi Haruka、Kato Yoshinobu、Fujita Tomoya、Iwasaki Shintaro、Nakamura Masayuki、Nishimura Yoshiki、Takenaka Mizuki、Shikanai Toshiharu
  • Journal Title: Plant and Cell Physiology Volume: - Issue: 7 Pages: 1-10
  • DOI: 10.1093/pcp/pcaa180
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Spliceostatin A interaction with SF3B1 limits U1 snRNP availability and causes premature cleavage and polyadenylation. (2021)
  • Author(s): Yoshimoto, R., Chhipi-Shrestha, J.K., Schneider-Poetsch, T., Furuno, M., Burroughs, A.M., Noma, S., Suzuki, H., Hayashizaki, Y., Mayeda, A., Nakagawa, S., Kaida, D., Iwasaki, S., Yoshida, M.
  • Journal Title: Cell Chem. Biol. Volume: - Issue: 9 Pages: 1356-1365
  • DOI: 10.1016/j.chembiol.2021.03.002
  • Peer Reviewed / Int'l Joint Research
• [Journal Article] Dual targeting of DDX3 and eIF4A by the translation inhibitor rocaglamide A (2021)
  • Author(s): Chen Mingming、Asanuma Miwako、Takahashi Mari、Shichino Yuichi、Mito Mari、Fujiwara Koichi、Saito Hironori、Floor Stephen N.、Ingolia Nicholas T.、Sodeoka Mikiko、Dodo Kosuke、Ito Takuhiro、Iwasaki Shintaro
  • Journal Title: Cell Chemical Biology Volume: 28 Issue: 4 Pages: 475-486
  • DOI: 10.1016/j.chembiol.2020.11.008
  • Peer Reviewed / Int'l Joint Research
• [Journal Article] Genome-wide survey of ribosome collision. (2020)
  • Author(s): Han, P., Shichino, Y., Schneider-Poetsch, T., Mito, M., Hashimoto, S., Udagawa, T., Kohno, K., Yoshida, M., Mishima, Y., Inada, T., Iwasaki, S.
  • Journal Title: Cell Rep. Volume: 31(5) Issue: 5 Pages: 107610-107610
  • DOI: 10.1016/j.celrep.2020.107610
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] N-terminal deletion of Swi3 created by the deletion of a dubious ORF YJL175W mitigates protein burden effect in S. cerevisiae (2020)
  • Author(s): Saeki Nozomu、Eguchi Yuichi、Kintaka Reiko、Makanae Koji、Shichino Yuichi、Iwasaki Shintaro、Kanno Manabu、Kimura Nobutada、Moriya Hisao
  • Journal Title: Scientific Reports Volume: 10 Issue: 1 Pages: 9500-9500
  • DOI: 10.1038/s41598-020-66307-z
  • NAID: 120006883501
  • Peer Reviewed / Open Access / Int'l Joint Research
• [Journal Article] Implications of RNG140 (caprin2)-mediated translational regulation in eye lens differentiation (2020)
  • Author(s): Kaori Nakazawa, Yuichi Shichino,Shintaro Iwasaki, and Nobuyuki Shiina
  • Journal Title: Journal of Biological Chemistry Volume: 295 Issue: 44 Pages: 15029-15044
  • DOI: 10.1074/jbc.ra120.012715
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] Complete chemical structures of human mitochondrial tRNAs (2020)
  • Author(s): Suzuki Takeo、Yashiro Yuka、Kikuchi Ittoku、Ishigami Yuma、Saito Hironori、Matsuzawa Ikuya、Okada Shunpei、Mito Mari、Iwasaki Shintaro、Ma Ding、Zhao Xuewei、Asano Kana、Lin Huan、Kirino Yohei、Sakaguchi Yuriko、Suzuki Tsutomu
  • Journal Title: Nature Communications Volume: 11 Issue: 1 Pages: 1-15
  • DOI: 10.1038/s41467-020-18068-6
  • Peer Reviewed / Open Access / Int'l Joint Research
• [Journal Article] Ribosomal protein S7 ubiquitination during ER stress in yeast is associated with selective mRNA translation and stress outcome (2020)
  • Author(s): Matsuki Yasuko、Matsuo Yoshitaka、Nakano Yu、Iwasaki Shintaro、Yoko Hideyuki、Udagawa Tsuyoshi、Li Sihan、Saeki Yasushi、Yoshihisa Tohru、Tanaka Keiji、Ingolia Nicholas T.、Inada Toshifumi
  • Journal Title: Scientific Reports Volume: 10 Issue: 1 Pages: 19669-19669
  • DOI: 10.1038/s41598-020-76239-3
  • Peer Reviewed / Open Access / Int'l Joint Research
• [Journal Article] Protocol for disome profiling to survey ribosome collision in humans and zebrafish. (2020)
  • Author(s): Mito M, Mishima Y, and Iwasaki S
  • Journal Title: STAR Protoc. Volume: 1 Issue: 3 Pages: 100168-100168
  • DOI: 10.1016/j.xpro.2020.100168
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Presentation] 抗がん作用をもつ小分子Rocaglamide AによるDDX3とeIF4Aを介した二重翻訳阻害 (2020)
  • Author(s): 岩崎信太郎
  • Organizer: 第93回日本生化学大会
  • Invited
• [Remarks]
  • URL: http://iwasakirna.com/publications.php
• [Remarks]
  • URL: https://www.riken.jp/research/labs/chief/rna_sys_biochem/index.html