Elucidation of the mechanisms of multiple localization and its regulation of cellular proteins

• Project Area: Multifaceted Proteins: Expanding and Transformative Protein World
• Project/Area Number: 20H05929
• Research Category: Grant-in-Aid for Transformative Research Areas (A)
• Allocation Type: Single-year Grants
• Review Section: Transformative Research Areas, Section (III)
• Research Institution: Kyoto Sangyo University
• Principal Investigator: 遠藤 斗志也 京都産業大学, 生命科学部, 教授 (70152014)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 松本 俊介 九州大学, 農学研究院, 助教 (70704295)
• Project Period (FY): 2020-11-19 – 2025-03-31
• Project Status: Granted (Fiscal Year 2024)
• Budget Amount: ¥145,080,000 (Direct Cost: ¥111,600,000、Indirect Cost: ¥33,480,000); Fiscal Year 2024: ¥24,830,000 (Direct Cost: ¥19,100,000、Indirect Cost: ¥5,730,000); Fiscal Year 2023: ¥25,350,000 (Direct Cost: ¥19,500,000、Indirect Cost: ¥5,850,000); Fiscal Year 2022: ¥25,350,000 (Direct Cost: ¥19,500,000、Indirect Cost: ¥5,850,000); Fiscal Year 2021: ¥24,050,000 (Direct Cost: ¥18,500,000、Indirect Cost: ¥5,550,000); Fiscal Year 2020: ¥45,500,000 (Direct Cost: ¥35,000,000、Indirect Cost: ¥10,500,000)
• Keywords: ミトコンドリア / Msp1 / ER / Spf1 / ATAD1 / 細胞内局在の校正 / TAタンパク質 / GETシステム / タンパク質配送の校正 / AAA-ATPアーゼ / テイルアンカータンパク質

Outline of Research at the Start

ミトコンドリア外膜のAAA-ATPアーゼのMsp1は，外膜に誤配送されたテイルアンカー（TA）タンパク質をATPのエネルギーを使って引き抜いてER膜に送り込むことで，誤配送タンパク質の分解か配送やり直しかが決まる。本研究では以下の問いに答えることをめざす。（1）Msp1の基質はどこまで一般化できるか？（2）Msp1は他のオルガネラでも機能できるか？（3）Msp1の配送の校正にパートナー因子は必要か。（4）校正基質はオルガネラ間コンタクト部位を介して移動するか。これらの研究を通じて，「タンパク質の配送の校正」という，タンパク質の細胞内局在様式に関わる新たな概念と原理を確立したい。

Outline of Annual Research Achievements

われわれは，タンパク質の配送にはやり直し(校正)機構が存在すること，すなわちミトコンドリア外膜のAAA-ATPアーゼのMsp1がミトコンドリア外膜に誤配送された膜タンパク質を検出して引き抜き，ER膜に送り，ERで分解するか配送をやり直すかが決まることを見出した。本研究では，Msp1による「誤配送の校正」の分子機構の詳細を解明するとともに，ERやペルオキシソームのような他のオルガネラでも同様の校正が起こるのかどうか，校正に関与する因子，機構はどのようなものかを明らかにする。そして細胞内のタンパク質局在化における「局在化の校正」機構の意義とインパクトを明らかにすることを目指している。
これまでに，Msp1によってミトコンドリア外膜から引き抜かれた誤配送テイルアンカー(TA)タンパク質がERに移動すること，この移動にはサイトゾルのシャペロンGet3とそのER上の受容体Get1/2（合わせてGETシステムと呼ぶ）が関わることを明らかにした。さらに人為的にミトコンドリアに誤配送させたモデル基質だけでなく，オーセンティックなERタンパク質もGETシステムを一過的に除去してミトコンドリアに誤配送させると,やはりMsp1によってERに戻されることがわかった。これらの解析結果を，論文発表した（J. Cell Biol. 2022）。
同様の校正がERで起こる可能性について注目されるのが，ERのATPアーゼのSpf1である。Spf1が欠損するとミトコンドリア外膜のタンパク質（TAタンパク質と一部のNアンカータンパク質）がERに誤局在し，Spf1を発現するとミトコンドリアへの正常な局在が回復することをケイ光顕微鏡のタイムラプス観察により見出した。これらの結果はSpf1がミトコンドリアとER間での膜タンパク質の正しい局在化を調節していることを示唆するものと考えられる。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

これまでに，Msp1欠損時にペルオキシソームからミトコンドリアに誤配送されるモデル基質Pex15Δ30が，Msp1の発現を回復させることによってミトコンドリア外膜から引き抜かれてERに移動すること，この移動にはGETシステムが関わることを明らかにした。さらにMsp1欠損時にGet3の一過的除去によってミトコンドリアに誤配送させたオーセンティックなERタンパク質Frt1も，Msp1の発現を回復させることによってERに戻されることがわかった。
次にERのATPアーゼであるSpf1が欠損するとミトコンドリア外膜のTAタンパク質や一部のNアンカータンパク質がERに誤局在し，Spf1を発現するとミトコンドリアへの正常な局在が回復することを見出した。ERに移動するNアンカータンパク質はミトコンドリア上でオリゴマーを作りにくい場合に限られることから，いったんミトコンドリアに局在したタンパク質がある確率でERに移動しうる可能性が示唆される。これらの結果はSpf1がミトコンドリアとER間での膜タンパク質の正しい局在化を調節していることを示唆するものと考えられ，これまでのタンパク質の細胞内交通の概念を大きく書き換える可能性が出てきた。

Strategy for Future Research Activity

ミトコンドリア外膜に誤配送されたタンパク質は，外膜のATPアーゼのMsp1が配送やり直しを促すが，ペルオキシソームタンパク質をミトコンドリアに誤配送させる実験系がこれまでは限定的であった。そこでオーキシン誘導型分解法によりPex19を急速分解できる系を利用して，あらたにペルオキシソーム膜タンパク質をミトコンドリアに誤配送させ，誤配送ペルオキシソーム膜タンパク質のMsp1に依存した配送のやり直しを蛍光顕微顕微鏡タイムラプス観察により検証する。Msp1のN端膜貫通（TM）配列を，ミトコンドリア，ER, ペルオキシソームのNアンカー型膜タンパク質のTM配列に置き換えたタンパク質を作製する。野生型Msp1はミトコンドリアだけでなく，ペルオキソームに一部局在するので，ミトコンドリアのみ，ペルオキシソームのみに存在するMsp1を作製し，各オルガネラの膜タンパク質の局在にどのような変化が起こるかを調べる。次に，最近松本らがクライオEM構造決定に成功した耐熱性酵母由来Msp1について，得られた構造を基に変異体の機能解析を行う。また，酵母発現系より膜貫通配列を含む全長Msp1とモデル基質（Pex15Δ30）複合体を調製し，クライオEMによる構造解析を進める。
昨年度に引き続き，spf1Δ株におけるミトコンドリア外膜タンパク質の局在の撹乱が，発現を回復したSpf1だけでなく，ERに人為的に局在化させたMsp1によっても回復できるかどうかを調べる。Spf1の役割については，いったんミトコンドリアに移行したタンパク質が何らかの機構でERに誤配送された段階でその局在を校正するだけでなく，新規ミトコンドリア外膜タンパク質の正しい局在化にも関わる可能性を見出した。Spf1による誤配送タンパク質および新規合成タンパク質のミトコンドリアへの（再）配送の分子機構の解明に向けて実験を進める。

Research Products

• [Journal Article] Msp1-mediated proofreading mechanism for localization of tail-anchored membrane proteins (2023)
  • Author(s): Matsumoto Shunsuke
  • Journal Title: The Journal of Biochemistry Volume: 173 Issue: 1 Pages: 13-20
  • DOI: 10.1093/jb/mvad025
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] GET pathway mediates transfer of mislocalized tail-anchored proteins from mitochondria to the ER (2022)
  • Author(s): Matsumoto Shunsuke、Ono Suzuka、Shinoda Saori、Kakuta Chika、Okada Satoshi、Ito Takashi、Numata Tomoyuki、Endo Toshiya
  • Journal Title: Journal of Cell Biology Volume: 221 Issue: 6 Pages: 202-202
  • DOI: 10.1083/jcb.202104076
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] Proofreading of protein localization mediated by a mitochondrial AAA-ATPase Msp1 (2022)
  • Author(s): Matsumoto Shunsuke、Endo Toshiya
  • Journal Title: The Journal of Biochemistry Volume: 173 Issue: 4 Pages: 265-271
  • DOI: 10.1093/jb/mvac097
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] ミトコンドリアAAA-ATPアーゼMsp1による誤配送タンパク質の配送校正機 (2021)
  • Author(s): 松本俊介，遠藤斗志也
  • Journal Title: 生化 Volume: 93 Pages: 512-516
  • Peer Reviewed
• [Presentation] ミトコンドリア外膜に誤配送されたテイルアンカー型タンパク質の配送校正機 (2022)
  • Author(s): 松本俊介，小野鈴花，遠藤斗志也
  • Organizer: 第22回日本蛋白質科学会年会 ワークショップ「細胞内タンパク質世界の新視点」
  • Invited
• [Presentation] Protein machineries that make and maintain mitochondria (2022)
  • Author(s): Toshiya Endo
  • Organizer: Mitochondria and Friends 2.0: Scientific Symposium Dedicated to the Memory of Walter Neupert
  • Int'l Joint Research / Invited
• [Presentation] Protein machineries in transport and re-transport of mitochondrial proteins (2022)
  • Author(s): Toshiya Endo
  • Organizer: EMBO Workshop on New Challenges in Protein Translocation across Membranes
  • Int'l Joint Research / Invited
• [Presentation] 膜タンパク質局在化における配送校正機構の解明 (2022)
  • Author(s): 松本俊介，小野鈴花，遠藤斗志也
  • Organizer: 第95回日本生化学会大会 日本生化学会奨励賞受賞講演
  • Invited
• [Presentation] Pathways and machineries that mediate and regulate mitochondrial protein traffickin (2022)
  • Author(s): Toshiya Endo
  • Organizer: ISF Workshop: Mitochondria Past and Present - Evolution, Proteostasis, Dynamics and Disease
  • Int'l Joint Research / Invited
• [Presentation] タンパク質の交通が制御するミトコンドリアプロテオスタシスの解明 (2022)
  • Author(s): 遠藤斗志也
  • Organizer: タンパク質研究シンポジウム
  • Invited
• [Presentation] コエンザイムQ生合成経路におけるER局在型の酵母アルデヒドデヒドロゲナーゼHfd1の関与 (2022)
  • Author(s): 小西 雄大、阪上春花、竹田弘法、遠藤斗志也
  • Organizer: 第74回日本細胞生物学会大会
• [Presentation] Membrane protein quality control in mitochondria and the ER by Msp1 and Spf1 (2022)
  • Author(s): Suzuka Ono, Shunsuke Matsumoto, Toshiya Endo
  • Organizer: EMBO Workshop on New Challenges in Protein Translocation across Membranes
  • Int'l Joint Research
• [Presentation] Spf1が調節するミトコンドリア-ER間における膜タンパク質の再配送機構 (2022)
  • Author(s): 小野鈴花，遠藤斗志也
  • Organizer: 第45回日本分子生物学会年会
• [Presentation] 細胞内多重局在タンパク質Hfd1とTOM複合体の相互作用形態の探索 (2022)
  • Author(s): 小西雄大，阪上春花，竹田弘法，遠藤斗志也
  • Organizer: 第45回日本分子生物学会年会
• [Presentation] タンパク質の交通が解き明かすミトコンドリア生合成の仕組み (2021)
  • Author(s): 遠藤斗志也
  • Organizer: 第20回 日本ミトコンドリア学会年会
  • Invited
• [Presentation] Protein machineries that make and maintain mitochondria（Plenary lecture) (2021)
  • Author(s): Toshiya Endo
  • Organizer: 35th Annual Symposium of the Protein Society
  • Int'l Joint Research / Invited
• [Presentation] Proofreading of protein mislocalization mediated by a mitochondrial AAA-ATPase Msp1 (2021)
  • Author(s): 松本俊介，小野鈴花，遠藤斗志也
  • Organizer: 第44回 日本分子生物学会年会ワークショップ 「オルガネラ膜タンパク質の標的化と品質管理
  • Invited
• [Presentation] タンパク質の細胞内配送原理の再構 (2021)
  • Author(s): 遠藤斗志也
  • Organizer: 第94回日本生化学会大会 シンポジウム「マルチファセット・プロテインズ：拡大し変容するタンパク質の世界」
  • Invited
• [Presentation] ミトコンドリアAAA-ATPアーゼMsp1による誤配送タンパク質の配送校正機構 (2021)
  • Author(s): 松本俊介，小野鈴花，遠藤斗志也
  • Organizer: 第94回 日本生化学会大会 シンポジウム「多面的ミトコンドリア機能による生命機能制御
• [Presentation] 酵母アルデヒドデヒドロゲナーゼ Hfd1の細胞内二重局在の分子機構 (2021)
  • Author(s): 小西雄大，遠藤斗志也，阪上春花，竹田弘法，斉藤知加
  • Organizer: 第73回日本細胞生物学会大会
• [Remarks] 遠藤研ホームページ
  • URL: http://endolab.jp/wp/