Genome modality in interphase genome structure
| Project Area | Genome modality: understanding physical properties of the genome |
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| Project/Area Number |
20H05937
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| Research Category |
Grant-in-Aid for Transformative Research Areas (A)
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| Allocation Type | Single-year Grants |
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| Review Section |
Transformative Research Areas, Section (III)
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| Research Institution | Kyoto University (2023-2024)
Nagoya University (2020-2022) |
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Principal Investigator |
西山 朋子 京都大学, 理学研究科, 教授 (90615535)
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| Project Period (FY) |
2020-11-19 – 2025-03-31
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| Project Status |
Granted (Fiscal Year 2024)
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| Budget Amount *help |
¥156,000,000 (Direct Cost: ¥120,000,000、Indirect Cost: ¥36,000,000)
Fiscal Year 2024: ¥29,120,000 (Direct Cost: ¥22,400,000、Indirect Cost: ¥6,720,000)
Fiscal Year 2023: ¥29,120,000 (Direct Cost: ¥22,400,000、Indirect Cost: ¥6,720,000)
Fiscal Year 2022: ¥29,120,000 (Direct Cost: ¥22,400,000、Indirect Cost: ¥6,720,000)
Fiscal Year 2021: ¥27,560,000 (Direct Cost: ¥21,200,000、Indirect Cost: ¥6,360,000)
Fiscal Year 2020: ¥41,080,000 (Direct Cost: ¥31,600,000、Indirect Cost: ¥9,480,000)
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| Keywords | クロマチン高次構造 / DNAループ / SMC / クロマチン高次構造形成 / コヒーシン / 間期クロマチン構造 |
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| Outline of Research at the Start |
本研究では、長大なDNAが微小核内に収納されるしくみを解明するため、DNAループ形成に着目する。DNAループ形成を司ると考えられているのがSMCタンパク質複合体であるが、そのDNAループ形成機構は未だに明らかになっていない。本研究では、SMCタンパク質複合体の一つであるコヒーシンが間期核内でDNAをコンパクトに束ねてメゾスケールゲノム構を作りあげる仕組みを解明する。特にDNAの物性変化に着目し、剛直なdsDNAをループ状に変化させるメカニズムを明らかにする。さらに、この仕組みとコヒーシン病変異との関連性を検証することで、メゾスケールから疾患につながるゲノムモダリティ制御を明らかにする。
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| Outline of Annual Research Achievements |
長大なDNAをいかにして微小な核内に収納させるのかは、真核生物における重要な問いである。その一つの答えはヒストンによるDNAの巻き付けであるが、それに対し近年、DNAループ形成という全く異質のDNA構造がクロマチン高次構造形成に重要であることが分かってきている。このDNAループ形成を司ると考えられているのが、原核生物からヒトまで保存されているSMC（structural maintenance of chromosomes）タンパク質複合体である。本研究では、SMCタンパク質複合体の一つであるコヒーシンが間期核内でDNAをコンパクトに束ねてメゾスケールゲノム構造を作りあげる仕組みを解明することを目指す。とくにコヒーシンが作るDNAループ構造に着目し、その形成メカニズムを明らかにする。2021年度は、昨年度に着手したin vitro 一分子DNAループ形成解析系の構築と使用するタンパク質の精製を完了させ、DNAループ押出しのリアルタイム一分子観察を行うことに成功した。コヒーシン複合体のATP加水分解に伴う立体構造変化を阻害する変異体に予想外の表現系が得られたことから、本年度はこの表現型解析を行った。ATP加水分解によって引き起こされるコヒーシンヘッドドメイン間結合の解離を阻害する変異体を用いてDNAループ押出しを観察したところ、変異体コヒーシンではDNAループ押出効率が顕著に低下することが明らかになった。このことは、ATP加水分解に伴うヘッドドメイン間結合の解離が効率的なDNAループ押出しに必要である可能性を示唆しており、リング状のコヒーシン複合体のリング内径増加がDNAループ押出機構に重要な役割を果たしている可能性が考えられる。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
2021年度は、コヒーシンによるDNAループ形成のメカニズムを解明するため、昨年度構築を開始した生化学系とイメージングを用いたアプローチの準備を行った。これまでに精製が完了している、蛍光標識したヒトのコヒーシン複合体およびコヒーシンローダーNIPBL/Mau2複合体を用いて、DNAループ押出しのリアルタイム一分子観察を行い、DNAループ押し出しに必要な分子メカニズムの解明に取り組んだ。コヒーシン複合体はATP加水分解活性をもつが、そのDNAループ押し出しにおける役割は明らかになっていない。ATP加水分解に伴うコヒーシン立体構造の変化がDNAループ押し出しに及ぼす影響を明らかにするため、ATP加水分解によって引き起こされるコヒーシンヘッドドメイン間結合の解離を阻害する変異体を作製し、変異体によるDNAループ押し出しを観察したところ、変異体コヒーシンではDNAループ押出効率が顕著に低下することが明らかになった。このことは、ATP加水分解に伴うヘッドドメイン間結合の解離が効率的なDNAループ押出しに必要である可能性を示唆しており、リング状のコヒーシン複合体のリング内径増加がDNAループ押出機構に重要な役割を果たしている可能性が考えられる。また、コヒーシンリング内径の増加は細胞内機能の適切な遂行、とくにDNA複製の進行に必要であることが、変異体細胞株を用いた解析で示され、ATP加水分解に伴うコヒーシン複合体構造変化が、DNAループ押出だけでなく、細胞内機能とコヒーシンの相互関係の適切な維持に必要であることが明らかになった。
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| Strategy for Future Research Activity |
コヒーシンによるDNAループ形成のメカニズムの解明を引き続き進める。過去に報告されているDNAとコヒーシン複合体の化学的架橋実験から得られている情報を参考に、ヒトのコヒーシン複合体とDNAが高頻度に接触する可能性がある残基を予測したので、本年度は、これらの部位の変異体を作製し、DNAループ押出し活性（ループ形成速度・頻度・維持時間・ATPase活性等）を比較することで、DNAループ押出しを定量的に評価する。同時に、これらの残基付近にある、コヒーシン病の原因変異と同一の変異を導入することで、コヒーシン病変異とループ押出し活性の関連性についても検証する。
DNAループ押出しの分子メカニズムを一分子レベルで明らかにするため、コヒーシンローディング因子NIPBL、コヒーシンサブユニットSTAG1/2、Smc1/3サブユニットのヒンジ・ヘッド各ドメインを蛍光標識し、一分子FRETによってそれらのドメインの近接頻度をリアルタイムで定量する。野生型および上記各変異体におけるループ押出し活性と各ドメインの近接情報を比較することで、DNAループ押出しのメカニズムを考察する。コヒーシンと同じSMCタンパク質複合体のひとつであるコンデンシンによるループ押出についても、コヒーシンと同様に分子メカニズムの解明に取り組む。
これと並行して、上記で明らかにするDNAループ形成メカニズムが、発生時期に応じて変化するのか、あるいは不変なのかを明らかにするための発生実験系の構築を進める。本研究ではツメガエル初期胚を用いて、初期胚クロマチン構造を体細胞型構造と比較解析することで、その生化学的および物性的特徴の違いを明らかにする。この目的のため、2021年度にツメガエル初期胚発生系を立ち上げたため、発生時期に応じたクロマチン構造をHi-C法を用いて解析する系の確立を進める。
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Report
(2 results)
Research Products
(9 results)
