Genome modality in interphase genome structure

• Project Area: Genome modality: understanding physical properties of the genome
• Project/Area Number: 20H05937
• Research Category: Grant-in-Aid for Transformative Research Areas (A)
• Allocation Type: Single-year Grants
• Review Section: Transformative Research Areas, Section (III)
• Research Institution: Kyoto University (2022-2024); Nagoya University (2020-2021)
• Principal Investigator: 西山 朋子 京都大学, 理学研究科, 教授 (90615535)
• Project Period (FY): 2020-11-19 – 2025-03-31
• Project Status: Granted (Fiscal Year 2024)
• Budget Amount: ¥156,000,000 (Direct Cost: ¥120,000,000、Indirect Cost: ¥36,000,000); Fiscal Year 2024: ¥29,120,000 (Direct Cost: ¥22,400,000、Indirect Cost: ¥6,720,000); Fiscal Year 2023: ¥29,120,000 (Direct Cost: ¥22,400,000、Indirect Cost: ¥6,720,000); Fiscal Year 2022: ¥29,120,000 (Direct Cost: ¥22,400,000、Indirect Cost: ¥6,720,000); Fiscal Year 2021: ¥27,560,000 (Direct Cost: ¥21,200,000、Indirect Cost: ¥6,360,000); Fiscal Year 2020: ¥41,080,000 (Direct Cost: ¥31,600,000、Indirect Cost: ¥9,480,000)
• Keywords: クロマチン高次構造 / DNAループ / SMC / コヒーシン / クロマチン高次構造形成 / 間期クロマチン構造

Outline of Research at the Start

本研究では、長大なDNAが微小核内に収納されるしくみを解明するため、DNAループ形成に着目する。DNAループ形成を司ると考えられているのがSMCタンパク質複合体であるが、そのDNAループ形成機構は未だに明らかになっていない。本研究では、SMCタンパク質複合体の一つであるコヒーシンが間期核内でDNAをコンパクトに束ねてメゾスケールゲノム構を作りあげる仕組みを解明する。特にDNAの物性変化に着目し、剛直なdsDNAをループ状に変化させるメカニズムを明らかにする。さらに、この仕組みとコヒーシン病変異との関連性を検証することで、メゾスケールから疾患につながるゲノムモダリティ制御を明らかにする。

Outline of Annual Research Achievements

（1）コヒーシン・コンデンシンによるDNAループ形成のメカニズム
本年度は、昨年度に引き続き、コヒーシンによるDNAループ形成のメカニズムの解明を進めた。昨年度の研究で、過去に報告されているDNAとコヒーシン複合体の化学的架橋実験から得られている情報を参考に、ヒトのコヒーシン複合体とDNAが高頻度に接触する可能性がある残基を予測し、これらの部位の変異を有するタンパク質複合体の精製と細胞の作出を行った。Alphafold2による予測と、白血病で見られる変異を参考に、コヒーシンサブユニットの一つであり、白血病において高頻度で変異がみられるSTAG2のN末端欠損、C末端欠損、N末端側と中央領域における点変異を中心に7種類の変異体の作製を試みた。いずれも変異型タンパク質複合体の精製には成功し、変異型細胞の作出を現在行っているところである。これらの変異型タンパク質複合体を用いたDNAループ押出し活性の評価も並行している。コヒーシンによるDNAループ押出の詳細な分子メカニズムを一分子レベルで明らかにするための一分子FRET解析系の構築においては、STAG1―Scc1相互作用に着目し、Scc1およびSTAG1側の複数の変異体を作製することで、コヒーシンとDNAとの相互作用を観察するための実験系を構築した。
（2）発生時期に応じたクロマチン構造と物性の変化
昨年度立ち上げた発生過程におけるクロマチン高次構造解析法の確立に引き続き取り組んだ。また、発生過程におけるクロマチン構造制御因子の発現の増減を調べ、HiC解析と照らし合わせることでクロマチン構造変化の原因を考察するための予備データを取得した。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

2022年度は、DNAループ形成メカニズムを明らかにするための変異体作製を進めた。昨年度から引き続き解析を進行しているヘッドドメイン開閉操作可能なコヒーシン変異体については、変異体発現細胞の分裂期における表現型を解析し、ヘッドドメインを開いてコヒーシンリング内径を広げることが、コヒーシンのクロマチンからの解離にも必要であること、その阻害により、姉妹染色分体間接着が安定化し、過剰接着の表現型が現れることを明らかにした。さらにこの変異体発現細胞において、クロマチン高次構造をHiCを用いて解析し、ヘッドドメインの強制的なテザリングによってゲノムDNA上でのDNAループの数はほとんど変化しないが、より小さなループが消失し、より大きなループが増加する傾向にあることを明らかにした。
DNAループ形成メカニズムにおけるコヒーシンの非SMCサブユニットの役割を明らかにするため、過去に報告されているDNAとコヒーシン複合体の化学的架橋実験から得られている情報を参考に、ヒトのコヒーシン複合体とDNAが高頻度に接触する可能性がある残基を予測し、これらの部位の変異を有するタンパク質複合体の精製と細胞の作出を行った。Alphafold2による構造予測と、白血病で見られる変異を参考に、コヒーシンサブユニットの一つであり、白血病において高頻度で変異がみられるSTAG2のN末端欠損、C末端欠損、N末端側と中央領域における点変異を中心に7種類の変異体の作製を試みた。いずれも変異型タンパク質複合体を精製できた。

Strategy for Future Research Activity

コヒーシンのヘッドドメイン開閉によるリング構造変化の重要性を細胞内で明らかにするため、強制的テザリングが可能な細胞において、RNAseq等の手法によって遺伝子発現の変化を解析する。また、一分子解析のために作製している7種類のSTAG2変異体を有するコヒーシン複合体を用いたDNAループ押出し活性の評価を行い、野生型と比較する。これと並行して、これらの変異体を発現する細胞をゲノム編集を用いて作製し、細胞内での機能解析を行う。
コヒーシンによるDNAループ押出しの一分子レベルのメカニズムを明らかにするための一分子FRET解析系の構築を引き続き進め、一分子FRETが安定して再現性良く機能する系を構築する。一方今年度作製したSTAG1―Scc1相互作用に着目した変異体について、Scc1およびSTAG1の結合性や、DNAへのコヒーシンの結合性をEMSAや一分子観察で評価し、DNAループ押出しや接着機構のメカニズムを考察する。

Research Products

• [Journal Article] Cell cycle-specific loading of condensin I is regulated by the N-terminal tail of its kleisin subunit (2022)
  • Author(s): S. Tane, K. Shintomi, K. Kinoshita, Y. Tsubota, M. M. Yoshida, T. Nishiyama, and T. Hirano
  • Journal Title: eLife Volume: 11 Pages: 1-23
  • DOI: 10.7554/elife.84694
  • Peer Reviewed / Open Access / Int'l Joint Research
• [Journal Article] A loop extrusion-independent mechanism contributes to condensin I-mediated chromosome shaping (2022)
  • Author(s): Kinoshita Kazuhisa、Tsubota Yuko、Tane Shoji、Aizawa Yuuki、Sakata Ryota、Takeuchi Kozo、Shintomi Keishi、Nishiyama Tomoko、Hirano Tatsuya
  • Journal Title: Journal of Cell Biology Volume: 221 Issue: 3
  • DOI: 10.1083/jcb.202109016
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] Opening of cohesin’s SMC ring is essential for timely DNA replication and DNA loop formation (2021)
  • Author(s): Sakata Ryota、Niwa Kyoma、Ugarte La Torre Diego、Gu Chenyang、Tahara Eri、Takada Shoji、Nishiyama Tomoko
  • Journal Title: Cell Reports Volume: 35 Issue: 4 Pages: 1-13
  • DOI: 10.1016/j.celrep.2021.108999
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Presentation] Ring structure of cohesin is essential for genome structure and functions (2022)
  • Author(s): Tomoko Nishiyama
  • Organizer: 第74回 日本細胞生物学会
  • Invited
• [Presentation] Alteration of cohesin ring conformation regulates DNA loop extrusion and genome functions (2022)
  • Author(s): Tomoko Nishiyama
  • Organizer: Genome organisation by SMC complexes
  • Int'l Joint Research / Invited
• [Presentation] コヒーシンの構造が制御する染色体機能 (2022)
  • Author(s): 西山朋子
  • Organizer: 遺伝研究会
  • Invited
• [Presentation] Ring conformation of cohesin regulates DNA loop extrusion and genome functions (2022)
  • Author(s): Tomoko Nishiyama
  • Organizer: 第45回 日本分子生物学会
  • Invited
• [Presentation] Single-molecule approaches for understanding chromosome architecture (2022)
  • Author(s): Tomoko Nishiyama
  • Organizer: 30th Hot Spring Harbor International Symposium
  • Int'l Joint Research / Invited
• [Presentation] Cohesin’s ring structure and genome functions (2021)
  • Author(s): Tomoko Nishiyama
  • Organizer: 59th Annual Meeting of the Biophysical Society in Japan
  • Int'l Joint Research / Invited
• [Presentation] Opening cohesin's ring structure is essential for genome functions (2021)
  • Author(s): Tomoko Nishiyama
  • Organizer: 44th Annual Meeting of the Molecular Biology Society in Japan
  • Int'l Joint Research / Invited
• [Presentation] Single-molecule approaches for understanding genome architecture (2021)
  • Author(s): Tomoko Nishiyama
  • Organizer: 2nd ASHBi SignAC Workshop
  • Int'l Joint Research / Invited
• [Presentation] Opening of cohesin’s Smc ring is essential for timely DNA replication (2021)
  • Author(s): Tomoko Nishiyama
  • Organizer: 第38回 染色体ワークショップ
• [Remarks] 西山研ホームページ
  • URL: https://www.bio.nagoya-u.ac.jp/~nishiyama/Nishiyamalab-home.html
• [Remarks] 名古屋大学プレスリリース
  • URL: https://www.nagoya-u.ac.jp/about-nu/public-relations/researchinfo/upload_images/20210511_sci.pdf