Genome modality in germ cells and its implications in diseases

• Project Area: Genome modality: understanding physical properties of the genome
• Project/Area Number: 20H05939
• Research Category: Grant-in-Aid for Transformative Research Areas (A)
• Allocation Type: Single-year Grants
• Review Section: Transformative Research Areas, Section (III)
• Research Institution: The University of Tokyo
• Principal Investigator: 岡田 由紀 東京大学, 定量生命科学研究所, 教授 (60546430)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 元池 育子 東北大学, 東北メディカル・メガバンク機構, 准教授 (70347178)
• Project Period (FY): 2020-11-19 – 2025-03-31
• Project Status: Granted (Fiscal Year 2024)
• Budget Amount: ¥131,820,000 (Direct Cost: ¥101,400,000、Indirect Cost: ¥30,420,000); Fiscal Year 2024: ¥27,690,000 (Direct Cost: ¥21,300,000、Indirect Cost: ¥6,390,000); Fiscal Year 2023: ¥27,690,000 (Direct Cost: ¥21,300,000、Indirect Cost: ¥6,390,000); Fiscal Year 2022: ¥27,690,000 (Direct Cost: ¥21,300,000、Indirect Cost: ¥6,390,000); Fiscal Year 2021: ¥27,170,000 (Direct Cost: ¥20,900,000、Indirect Cost: ¥6,270,000); Fiscal Year 2020: ¥21,580,000 (Direct Cost: ¥16,600,000、Indirect Cost: ¥4,980,000)
• Keywords: 精子クロマチン / クロマチン凝縮 / 男性不妊 / in vitro再構成 / ex vivo再構成 / ATAC-seq / プロタミン

Outline of Research at the Start

多くの脊椎動物の精子クロマチンは高度に凝縮しているが、この構造の詳細は未解明である。本研究課題では、精製タンパク質や生化学的に抽出した精子クロマチンを用いて、以下の３つの目標を設定する。(目標１)DNA物性の観点から、精子クロマチンの局所構造を明らかにする; (目標２)精子核内における染色体配置を明らかにし、動物種間比較によりその生物学意義を探る; (目標３)プロタミン凝集異常を定量化し、男性不妊症の理解に繋げる。このように、精子クロマチンを多階層から解析し、その構造や機能を明らかにすることで、ゲノムモダリティ制御の観点から、従来の学術枠では成し得なかった新たな精子学を展開する。

Outline of Annual Research Achievements

本研究課題の目標：(１)DNA物性の観点から、精子クロマチンの局所構造を明らかにする; (２)精子核内染色体配置を明らかにし、種間比較によりその生物学意義を探る; (３)プロタミン凝集異常を定量化し、男性不妊症の理解に繋げる。当該年度の実績は以下である。

目標１：精子クロマチンの試験管内再構成と、ex vivo再構成を計画している。再構成ヌクレオプロタミンのAFM観察（Wong班）、リポソーム内での再構成（瀧ノ上班鈴木グループ）を領域内共同研究で実施した。その結果、AFM観察では再構成ヌクレオプロタミンの二価イオンに対する反応とその構造を観察することに成功した。Ex vivoは精子クロマチン構造に対する二価イオンの影響の検討が終了し、研究は精子エピゲノム改変にシフトした。膨化精子に試験管内で脱メチル化酵素を加えた結果、処理精子は当該メチル化が完全に消失し、さらに様々なヒストンの存在量に異常をきたした。この精子を顕微授精に供した結果、雄性前核のクロマチン構造異常が認められた。
目標２：本項目は目標3のATAC-seqの結果に基づいてFISHでヒト・マウス・ブタの染色体配置を検討する予定であったが、今年度から領域内前澤班と連携し、核膜結合クロマチンの変化を追跡している。当班では精子核凝縮時にダイナミックに変化する核膜分子に着目し、ノックアウトマウスを作製した結果、核内ヒストン局在の変化と精子運動障害が観察された。
目標３：プロタミン凝集異常を定量化する目的で、マウス精子形成過程のATAC-seq、RNA-seq、ChIP-seqを行い、精子形成過程におけるクロマチン構造と転写、プロタミン置換との時空間的な関係を明らかにすることができた。ヒト精子のATAC-seqデータは既に取得済みである。翌年度はプロタミンKOマウスを用いた確認実験を施行し、論文発表とする。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

目標１：In vitro再構成では、AFMで新規の知見が得られた（論文準備中）。Ex vivo再構成では二価イオンの検討が終了した。精子エピゲノム改変では、標的としたエピゲノム以外にも変化が見られるという、予想しなかった知見が得られた。

目標２：FISH解析を中断し、核膜ダイナミクスに着目した研究にシフトしたが、速やかにKOマウスが得られ、興味深い表現型が得られた。

目標３：データ取得がおおむね終了し、あとはKOマウスを使ったコントロール実験を残すのみとなっている。

Strategy for Future Research Activity

目標１：ex vivoエピゲノム改変に注力する。現在のプロトコルでは、実験処理に起因する精子DNA傷害が否定できず、ここを解決することが今後の課題である。In vitro再構成は共同研究を主体に進める。

目標２：前澤班と連携して、精子形成における核膜ダイナミクスの解明を精力的に進める。現在、前澤班の実験に必要なKOマウスを作製している。当班の研究項目では、既に、作製したKOマウスから表現型が得られているため、このマウスの解析を進める。核膜因子のため、Wong班との連携を予定している。

目標３：論文発表を行う。

Research Products

• [Journal Article] Isolation of stage‐specific spermatogenic cells by dynamic histone incorporation and removal in spermatogenesis (2023)
  • Author(s): Fujiwara Yasuhiro、Hada Masashi、Fukuda Yuko、Koga Chizuko、Inoue Erina、Okada Yuki
  • Journal Title: Cytometry Part A Volume: 105 Issue: 4 Pages: 297-307
  • DOI: 10.1002/cyto.a.24812
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] Sperm chromatin condensation: epigenetic mechanisms to compact the genome and spatiotemporal regulation from inside and outside the nucleus (2022)
  • Author(s): Okada Yuki
  • Journal Title: Genes & Genetic Systems Volume: 97 Issue: 1 Pages: 41-53
  • DOI: 10.1266/ggs.21-00065
  • ISSN: 1341-7568, 1880-5779
  • Year and Date: 2022-02-01
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] Solubilization of Mouse Sperm Chromatin for Sequencing Analyses Using a Chaperon Protein (2022)
  • Author(s): Yuko Fukuda, Keishi Shintomi, Kosuke Yamaguchi, Yasuhiro Fujiwara, Yuki Okada
  • Journal Title: Methods in Molecular Biology Volume: 2577 Pages: 161-173
  • DOI: 10.1007/978-1-0716-2724-2_11
  • ISBN: 9781071627235, 9781071627242
  • Peer Reviewed / Int'l Joint Research
• [Journal Article] Sperm chromatin structure: Insights from in vitro to in situ experiments. (2022)
  • Author(s): Yuki okada
  • Journal Title: Current Opinion in Cell Biology Volume: 75 Pages: 102075-102075
  • DOI: 10.1016/j.ceb.2022.102075
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Presentation] Tracking dynamic chromatin changes in spermatogenesis (2023)
  • Author(s): 岡田由紀
  • Organizer: 第97回日本薬理学会年会
  • Invited
• [Presentation] Isolation of Stage-Specific Spermatogenic Cells Using Histone Exchange and Application to Sperm Chromatin Dynamics Analysis (2023)
  • Author(s): 岡田由紀
  • Organizer: 第45回日本分子生物学会年会
  • Invited
• [Presentation] Tracking dynamic chromatin changes in spermatogenesis (2023)
  • Author(s): 岡田由紀
  • Organizer: 第96回日本生化学会年会
  • Invited
• [Presentation] 精子クロマチンの操作と測定 (2022)
  • Author(s): 岡田由紀
  • Organizer: 大阪大学蛋白研セミナー
  • Invited
• [Presentation] NGS解析によるヒト精子エピゲノムプロフィール多様性の検討 (2022)
  • Author(s): 岡田由紀
  • Organizer: 第115回繁殖生物学会年会
  • Invited
• [Presentation] 精子クロマチンの操作と測定 (2021)
  • Author(s): 岡田由紀
  • Organizer: 第59回生物物理学会年会
  • Invited
• [Presentation] Investigation of human sperm chromatin heterogeneity and sperm quality using ATAC-seq (2021)
  • Author(s): 岡田由紀
  • Organizer: 第44回日本分子生物学会年会
• [Remarks] 研究室ホームページ（研究業績のページ）
  • URL: https://okadalab.iqb.u-tokyo.ac.jp/publication/
• [Remarks] 研究室ホームページ（研究業績のページ）
  • URL: https://webpark2349.sakura.ne.jp/okadalab/publication/