House construction with animal fibers in the chordate, Oikopleura dioica..

• Project Area: Material properties determine body shapes and their constructions
• Project/Area Number: 20H05946
• Research Category: Grant-in-Aid for Transformative Research Areas (A)
• Allocation Type: Single-year Grants
• Review Section: Transformative Research Areas, Section (III)
• Research Institution: Kagoshima University
• Principal Investigator: 小沼 健 鹿児島大学, 理工学域理学系, 准教授 (30632103)
• Project Period (FY): 2020-11-19 – 2025-03-31
• Project Status: Granted (Fiscal Year 2024)
• Budget Amount: ¥60,970,000 (Direct Cost: ¥46,900,000、Indirect Cost: ¥14,070,000); Fiscal Year 2024: ¥13,780,000 (Direct Cost: ¥10,600,000、Indirect Cost: ¥3,180,000); Fiscal Year 2023: ¥13,780,000 (Direct Cost: ¥10,600,000、Indirect Cost: ¥3,180,000); Fiscal Year 2022: ¥13,780,000 (Direct Cost: ¥10,600,000、Indirect Cost: ¥3,180,000); Fiscal Year 2021: ¥13,130,000 (Direct Cost: ¥10,100,000、Indirect Cost: ¥3,030,000); Fiscal Year 2020: ¥6,500,000 (Direct Cost: ¥5,000,000、Indirect Cost: ¥1,500,000)
• Keywords: ハウス / オタマボヤ / 表皮細胞 / セルロース繊維 / 数理計算 / セルロース / 繊維素材 / 表皮 / CesA / 3D形成 / 3D形態 / 数理解析

Outline of Research at the Start

オタマボヤは、ハウスと呼ばれるセルロースの膜でできた「袋」の中に棲む。ハウスは、ダクトやフィルターがプランクトンを集め・ろ過する機能を持つように配置された、複雑な3D構造を持つ。オタマボヤは常にスペアのハウスを数枚まとっており、外側の一枚を数分かけて膨らませるとハウスが完成する。本研究では、細胞が「セルロース繊維をもちいた織物(編み物）」をどのように作るかという新しい観点のもと、ハウス形成の謎に迫る。生物学としての新奇性はきわめて高く、数理解析と実験とを循環させて理解を進めることにより、新たな工学技術へとつながる可能性がある。

Outline of Annual Research Achievements

オタマボヤは、表皮細胞から分泌される「ハウス」と呼ばれる袋状の構造に棲んでいる。ハウスはセルロースを含んでおり、海水中のプランクトンを濾し取って食べるための網目や流路（ダクト）が規則正しく配置された、複雑な三次元構造を備える。オタマボヤは、スペアのハウスを2-3枚、折りたたんだ状態でまとっており、外側の一枚を膨らませて使用する。代表者は予備実験をもとに、ハウスは「繊維状の素材」の組み合わせ、すなわち編み物（織物）とみなせると作業仮説を立てて、その実体の理解に取り組んだ。以下、本年度の成果の概要を述べる。
(1) ハウスの3D構造についての画像データの取得に成功した。ハウスはオタマボヤが内側から水圧をかけることで形を維持している。このため、固定すると容易に変形してへしゃげてしまう。この問題を解決する工夫を数年にわたり重ね、「ゼリー化試薬をもちいて固めてからセルロースを蛍光染色し、これを正立型双方向ライトシート顕微鏡 (QuViSPIM、総括班の共同利用機器）をもちいて記録する」方法を確立した。これにより、ほぼインタクトな状態の3D画像を取得できるようになった。
(2) 網目形成に、細胞骨格がかかわることが分かった。Fアクチンの重合阻害剤で処理したオタマボヤはハウスをつくるものの、餌フィルターや入口の格子状の網目が正しく形成できなくなる。さらに、網目形成の初期過程を観察することにも成功し、その結果、細胞骨格にそってセルロースの微小繊維を網目状に並べていく過程が過去に考えられていたものと異なることが分かった。
(3) セルロース合成酵素(CesA2)のホールマウントin situ hybridizationを確立した。その結果、ハウス形成のサイクルを反映するようにCesA2の発現領域に個体差があることや、これまで着目されていなかった表皮領域にCesA2が発現することが分かってきた。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

本研究のおもな計画は、ハウス形成をものづくりの視点からとらえ、(1) セルロース繊維の形成（一次元、ナノレベル)、(2) 網目の形成 (二次元の布状構造、マイクロレベル）、(3)ハウスの三次元構造の理解（ミリレベル）、それぞれのスケールから調べることにある。
本計画研究において最も困難であった実験が「ハウスの3D形態を撮影すること」であった。ハウスは柔らかく、細胞の固定法では変形してしまうため、正確な形状がわからないからである。蛍光顕微鏡やマイクロCTをもちいて、これまで数年にわたりこの問題を解決するために試行錯誤を続けてきた。今年度はついにこの問題を克服し、ほぼインタクトなハウスの3D構造の蛍光観察とZスタック画像の取得ができるようになった。計画班の船山グループによるQuViSPIM画像撮影の支援をはじめ、さまざまな班員のご協力のもと試みてきた数多くの取り組みが結実したものである。研究開始時の計画については、実行可能性の問題はおおむね克服の目処が立ったと言えるだろう。
さらに、網目形成のしくみや、CesA2の発現領域についても理解が進んでおり、上記 (1)-(3)すべてについて進展を得た。以上から、おおむね順調に進んでいると判断する。

Strategy for Future Research Activity

ハウスの三次元構造が記録できる状況に達したので、これを活用して以下 (1)-(3)を進める。
(1) ハウスの３Dプリンティング（計画班の山崎グループ、秋山グループとの連携）。内部構造の理解はもちろん、啓蒙活動にも役に立つと期待される。
(2) 表皮上でつくられる「ハウス原基（折りたたみ）」と「完成したハウス」との対応づけ。これらの三次元画像をもとに、その展開についての力学計算を実施する。すなわち、計画班の井上グループと連携してハウスを構成する各シート（平面）の変形としてハウスの展開を数理計算していただくことを目指す。実際の実験データ（Zスタック画像）から、シートの各部位の表面形状を抽出することを試みていく。
(3) ハウス原基の一部に油滴を埋めこみ、完成したハウスのどの部位に対応するのかマークする。さらに「ハウス原基の展開開始」について、その動画撮影、蛍光Zスタック画像の取得、走査型電子顕微鏡観察を継続する。これらにより、(2)の試みを実験面からサポートする知見を得る。
これらに加えて、「網目形成のしくみ」や「CesA2の発現によるハウス形成サイクルの解明」に取り組む。前者については、セルロース繊維を細胞上に網目状に配列させるために、細胞上でどのような変化が起きているかが問題といえる。細胞膜のライブイメージングによって、その観察を試みる。後者については、CesA2の発現細胞の表皮上での位置を、1細胞レベルの精密さでマッピングする。このために蛍光 in situ hybridyzationを実施する。
ハウス形成については、開始当初の３年前に比べて理解がかなり進んだ。これはこのとりくみが領域全体に周知され、理論系と実験系、また計画班と公募班をとわず、さまざまな協力（連携）をいただいたお陰といえる。これを進めて、表皮からハウスの3D構造をつくりだす原理の理解を目指したい。

Research Products

• [Journal Article] Formation of the brain by stem cell divisions of large neuroblasts in Oikopleura dioica, a simple Chordate. (2023)
  • Author(s): 1.Konishi M, Kishi K, Morita R, Yamada A, Onuma TA and Nishida H
  • Journal Title: Development Genes and Evolution. Volume: -
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Zic-r.b controls cell numbers in Ciona embryos by activating CDKN1B. (2023)
  • Author(s): Treen N, Konishi S, Nishida H; Onuma TA and Sasakura Y
  • Journal Title: Developmental Biology Volume: - Pages: 26-34
  • DOI: 10.1016/j.ydbio.2023.03.005
  • Peer Reviewed / Int'l Joint Research
• [Journal Article] The cosmopolitan appendicularian Oikopleura dioica reveals hidden genetic diversity around the globe. (2022)
  • Author(s): Masunaga A, Mansfield MJ, Tan Y, Liu AW, Bliznina A, Barzaghi P, Hodgetts TL, Ferrandez‐Roldan A, Canestro C, Onuma TA, Plessy C and Luscombe NM
  • Journal Title: Marine Biology Volume: 169 Issue: 12
  • DOI: 10.1007/s00227-022-04145-5
  • Peer Reviewed / Open Access / Int'l Joint Research
• [Journal Article] Differentiation of endostyle cells by Nkx2-1 and FoxE in the ascidian Ciona intestinalis type A: insights into shared gene regulation in glandular- and thyroid-equivalent elements of the chordate endostyle (2022)
  • Author(s): Yamagishi Masayuki、Huang Taoruo、Hozumi Akiko、Onuma Takeshi A.、Sasakura Yasunori、Ogasawara Michio
  • Journal Title: Cell and Tissue Research Volume: 390 Issue: 2 Pages: 189-205
  • DOI: 10.1007/s00441-022-03679-w
  • Peer Reviewed / Int'l Joint Research
• [Journal Article] Germline development during embryogenesis of the larvacean, Oikopleura dioica. (2022)
  • Author(s): Nishida, H., Matsuo, M., Konishi, S., Ohno, N., Manni, L., and Onuma T.A.
  • Journal Title: Devevalopmental Biology Volume: 481 Pages: 188-200
  • DOI: 10.1016/j.ydbio.2021.10.009
  • Peer Reviewed / Int'l Joint Research
• [Journal Article] Developmental biology of the larvacean Oikopleura dioica : Genome resources, functional screening, and imaging (2022)
  • Author(s): Onuma, T. A. and Nishida, H.
  • Journal Title: Dev. Growth Differ. Volume: 64 Issue: 1 Pages: 67-82
  • DOI: 10.1111/dgd.12769
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] Nkx2-1 and FoxE regionalize glandular (mucus-producing) and thyroid-equivalent traits in the endostyle of the chordate Oikopleura dioica. (2021)
  • Author(s): Onuma TA*, Nakanishi R, Sasakura Y and Ogasawara M*
  • Journal Title: Developmental Biology. Volume: 477 Pages: 219-231
  • DOI: 10.1016/j.ydbio.2021.05.021
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Massive gene loss and function shuffling in appendicularians stretch the boundaries of chordate Wnt family evolution (2021)
  • Author(s): Marti-Solans, J., Godoy, H., Diaz-Gracia, M., Onuma, T., Nishida, H., Albalat R., and Canestro, C.
  • Journal Title: Frontiers Cell Dev. Biol. Volume: 9 Pages: 700827-700827
  • DOI: 10.3389/fcell.2021.700827
  • Peer Reviewed / Open Access / Int'l Joint Research
• [Journal Article] オタマボヤの口形成にともなう外胚葉と内胚葉との接続. (2021)
  • Author(s): 小沼健*, 森田遼
  • Journal Title: 比較内分泌学. Volume: 174
• [Journal Article] Mouth opening is mediated by separation of dorsal and ventral daughter cells of the lip precursor cells in the larvacean, Oikopleura dioica. (2020)
  • Author(s): Morita, R., Onuma, T.A., Manni, L., Ohno, N., Nishida, H.
  • Journal Title: Dev. Genes Evol. Volume: 230 Issue: 5-6 Pages: 315-327
  • DOI: 10.1007/s00427-020-00667-4
  • Peer Reviewed / Int'l Joint Research
• [Journal Article] A genome database for a Japanese population of the larvacean Oikopleura dioica. (2020)
  • Author(s): Wang, K., Tomura, R., Chen, W., Kiyooka, M., Ishizaki, H., Aizu, T., Minakuchi, Y., Seki, Yutaka Suzuki, M., Omotezako, T., Suyama, R., Masunaga, A., Plessy, C., Luscombe, N.M., Dantec, C., Lemaire, P., Itoh, T., Toyoda, A., Nishida, H., and Onuma, T.A.
  • Journal Title: Dev. Growth Differ. Volume: 62 Issue: 6 Pages: 450-461
  • DOI: 10.1111/dgd.12689
  • Peer Reviewed / Open Access / Int'l Joint Research
• [Journal Article] Protein phosphatase 2A is essential to maintain meiotic arrest, and to prevent Ca2+ burst at spawning and eventual parthenogenesis in the larvacean Oikopleura dioica. (2020)
  • Author(s): Matsuo M, Onuma TA, Omotezako T and Nishida N
  • Journal Title: Developmental Biology. Volume: 460(2) Issue: 2 Pages: 155-163
  • DOI: 10.1016/j.ydbio.2019.12.005
  • Peer Reviewed / Int'l Joint Research
• [Presentation] オタマボヤハウスの形成: 繊維素材をもちいた形つくり (2023)
  • Author(s): 小沼健, 柳田夏希, 山崎慎太郎, 秋山正和, 上村了美, 駒野恭子, 船山典子, 西田宏記.
  • Organizer: 日本動物学会第94回大会, 第41回ホヤ談話会 (山形, 山形大学 小白川キャンパス, 2023/9/7-9).
  • Invited
• [Presentation] オタマボヤのハウス形成: 繊維素材をもちいた機能的な網目構造の設計. (2023)
  • Author(s): 小沼健, 柳田夏希, 山崎慎太郎, 秋山正和, 上村了美, 駒野恭子, 船山典子, 西田宏記.
  • Organizer: 日本機械学会 第35回バイオエンジニアリング講演会 (仙台, 日立システムズホール, 2023/6/4-5).
  • Invited
• [Presentation] 脊索動物ワカレオタマボヤを活用した発生生物学. (2022)
  • Author(s): 小沼健, 西田宏記.
  • Organizer: 日本動物学会 第93回大会, 大会シンポジウム「 海産無脊椎動物―生命情報の宝の山VII―オープンデータサイエンス」(東京, 早稲田大学 早稲田キャンパス, 2022/9/8-10)
  • Invited
• [Presentation] Transcriptomes of the fast-evolving chordate, Oikopleura dioica, uncover drastic difference in transcription factor and post-plasmic RNA composition that is expressed in early embryos from those of ascidians. (2022)
  • Author(s): Wang K, Suyama R, Mizutani N, Matsuo M, Peng Y, Seki M, Suzuki Y, Luscombe NM, Dantec C, Lemaire P, Toyoda A, Nishida H and Onuma TA.
  • Organizer: The 11th International Tunicate Meeting, oral presentation (Kobe, Konan University, 2022/07/10-15).
  • Int'l Joint Research
• [Presentation] オタマボヤとホヤの胚発生のしくみは異なるのか？：「転写因子の胚生発現」と「母性mRNAの局在」からその実体に迫る. (2022)
  • Author(s): 小沼健.
  • Organizer: 第7回ユニーク会. ポスター発表 (名古屋, 名古屋大学 野依記念学術交流館, 2022/9/20-21).
• [Presentation] オタマボヤをもちいて、体づくりのしくみを学ぶ. (2021)
  • Author(s): 小沼健.
  • Organizer: 日本動物学会 日本生態学会 九州沖縄植物学会 合同鹿児島例会
  • Invited
• [Presentation] 1世紀前の謎を解く-「最も単純な体の脊索動物」脊索動物オタマボヤをもちいて左右形成の新しい領域を開拓する. (2021)
  • Author(s): 小沼健.
  • Organizer: 2021年度動物学会中部支部大会 富山大会
  • Invited
• [Presentation] オタマボヤのハウス形成:セルロース繊維をもちいた形づくり. House construction with cellulose fibers in the larvacean, Oikopleura dioica. (2021)
  • Author(s): 小沼健, 山崎慎太郎, 秋山正和, 西田宏記.
  • Organizer: 日本動物学会第92回大会, 第39回ホヤ談話会
  • Invited
• [Presentation] オタマボヤのハウス建築: 動物性セルロースを用いた形づくり. (2021)
  • Author(s): 小沼健.
  • Organizer: 第6回ユニーク会
• [Presentation] オタマボヤ内柱における分泌関連および甲状腺関連形質の領域化. Regionalization of glandular and thyroid-equivalent traits in the endostyle of Oikopleura dioica. (2021)
  • Author(s): 小沼健, 中西梨奈, 笹倉靖徳, 小笠原道生.
  • Organizer: 日本動物学会第92回大会
• [Presentation] カタユウレイボヤ幼若体における内柱の領域化と細胞分化. Regionalization and differentiation of endostyle cells in the juvenile of Ciona intestinalis. (2021)
  • Author(s): 山岸雅幸, 小沼健, 笹倉靖徳, 小笠原道生.
  • Organizer: 日本動物学会第92回大会
• [Presentation] 原索動物の内柱における vWF 様遺伝子群の収斂的発現. Convergent expression of vWF-like genes in the protochodate endostyle. (2021)
  • Author(s): 板山紘典, 山岸雅幸, 小沼健, 笹倉靖徳, 小笠原道生.
  • Organizer: 日本動物学会第92回大会
• [Presentation] Transcriptomic analyses of the fast-developing chordate, Oikopleura dioica, uncover re-organization of transcription factors functioning in early embryos and the animal-vegetal axis specification. (2021)
  • Author(s): Kai Wang, Ritsuko Suyama, Nakako Mizutani, Masaki Matsuo, Yu Peng, Masahide Seki, Yutaka Suzuki, Nicholas M. Luscombe, Christelle Dantec, Patrick Lemaire, Atsushi Toyoda, Hiroki Nishida and Takeshi A. Onuma*
  • Organizer: 第54回日本発生生物学会
• [Presentation] オタマボヤをもちいて、体づくりのしくみを学ぶ. (2021)
  • Author(s): 小沼健.
  • Organizer: 日本動物学会 日本生態学会 九州沖縄植物学会 合同鹿児島例会
  • Invited
• [Remarks] ・小さな脊索動物、オタマボヤ (2/9, 19:00-初回放送）
  • URL: https://www.youtube.com/watch?v=bL1A8tF2lhk
• [Remarks] ・オタマボヤのハウス建築（2/16, 19:00-初回放送）
  • URL: https://www.youtube.com/watch?v=K4DwsGsAOwI
• [Remarks] オタマボヤの内柱がもつ２大機能領域の形成における甲状腺関連遺伝子の役割を解明
• [Remarks] 動物性繊維を用いてオタマボヤが「ハウス」を建築する原理
  • URL: https://seeds.krcc.kagoshima-u.ac.jp/seeds_info/index.php
• [Remarks] オタマボヤの内柱がもつ２大機能領域の形成における甲状腺関連遺伝子の役割を解明