| Project Area | Elucidation of the mechanisms of transcriptional unity by understanding spatiotemporal multifactorial interactions |
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| Project/Area Number |
21H05160
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| Research Category |
Grant-in-Aid for Transformative Research Areas (B)
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| Allocation Type | Single-year Grants |
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| Review Section |
Transformative Research Areas, Section (III)
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| Research Institution | Osaka University |
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Principal Investigator |
二村 圭祐 大阪大学, 大学院医学系研究科, 准教授 (00462713)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
粕川 雄也 国立研究開発法人理化学研究所, 生命医科学研究センター, チームリーダー (10304031)
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| Project Period (FY) |
2021-08-23 – 2024-03-31
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| Project Status |
Granted (Fiscal Year 2023)
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| Budget Amount *help |
¥53,040,000 (Direct Cost: ¥40,800,000、Indirect Cost: ¥12,240,000)
Fiscal Year 2023: ¥17,680,000 (Direct Cost: ¥13,600,000、Indirect Cost: ¥4,080,000)
Fiscal Year 2022: ¥17,680,000 (Direct Cost: ¥13,600,000、Indirect Cost: ¥4,080,000)
Fiscal Year 2021: ¥17,680,000 (Direct Cost: ¥13,600,000、Indirect Cost: ¥4,080,000)
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| Keywords | 多因子間相互作用 / 転写ユニティー / 遺伝子発現制御 / 遺伝子発現 / 転写ユニティー機構 / 分子間相互作用 |
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| Outline of Research at the Start |
細胞の遺伝子発現制御には多種多様なタンパク質や核酸の精緻な多因子間相互作用が必須である。そのため、タンパク質間の相互作用によって形成される複合体解析が行われてきた。しかし、これまでの手法では 多因子の間で生じる複雑な相互作用を空間的かつ定量的に解析することは困難である。そこで、本研究では、この複雑な多因子間相互作用を解析するために、複数の因子間の相互作用を空間的かつ定量的に解析する手法を開発する。この手法を開発することで、タンパク質、DNA、RNAによる多因子間相互作用によって形成される転写ユニティー機構を空間的かつ定量的に明らかにする。
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| Outline of Annual Research Achievements |
遺伝子発現は多数のタンパク質が複雑に相互作用した複合体によって制御される。そのため、遺伝子発現制御のメカニズムを解明していくためには、このような多因子間で形成される相互作用を検出するシステムを構築することが必要である。現在、B細胞をモデルに多因子間相互作用の検出法の開発を進めている。この方法はDNAバーコードを付加した抗体で細胞を反応させた後にポリマー中に細胞を封入し、PCR反応を行うものである。これまでの検討から、RNAポリメラーゼIIを中心とする10種類以上の転写制御因子が形成する多因子間相互作用を検出することができた。しかし、その解析の中から、DNAバーコード配列の改善がより精緻に相互作用を検出するために必要であることが示唆され、その配列の改善を行った。DNA配列の変更に伴い、PCR反応の条件を変更することが必要になり、その条件検討を詳細に行い、改良された条件でライブラリーの構築を進めた。さらに、DNAバーコード付加抗体による免疫染色においても、染色像がDNAバーコードを付加していない元の抗体と異なることがわかった。そこで、固定や透過、ブロッキングといった条件の最適化を行った。その結果、DNAバーコードを付加しても、未付加の抗体と同様の染色像を得ることができる条件を同定することができた。この条件で改良されたPCR条件で増幅反応を行うことで、量依存的な増幅を達成することができた。現在この条件で作製したライブラリーの解析を進めている。また、腫瘍の増殖を制御する転写制御機構の解明研究も進めた。非増殖性ウイルス療法の抗腫瘍効果を生み出すメカニズムを解析していく中で、腫瘍細胞においてある転写因子が発現することが重要であることがわかった。さらにこの転写因子を発現させるだけで抗腫瘍効果を誘導でき、その実行因子として脂質代謝関連分泌因子を同定した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
多因子間相互作用検出法の開発を進めている。予期せぬ問題が多数生じたものの、方法の改良を逐次行い、手法を最適化することが少なくともWet実験のデータからは達成できた。改良した方法で作製したライブラリーのシークエンシングを完了し、現在解析を進めている。また、腫瘍増殖を制御する転写制御機構の解明研究の成果を論文として投稿中である。そのため、おおむね順調に進展していると考える。
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| Strategy for Future Research Activity |
今後の研究の推進方策としては、転写制御因子が形成する多因子間相互作用を解析するシステムの開発を進める。さらに、腫瘍増殖を制御する転写制御機構の解明を進め、腫瘍増殖を抑制し得る転写制御ネットワークを同定する。この転写制御ネットワークを多因子間相互作用解析システムにより評価することで、タンパク質、DNA、RNAによる多因子間相互作用によって形成される転写ユニティー機構を空間的かつ定量的に明らかする。
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