Development of cross-scale technologies for investigating correlations of structures, dynamics, and functions of intracellular molecules

• Project Area: New cross-scale biology
• Project/Area Number: 21H05252
• Research Category: Grant-in-Aid for Transformative Research Areas (A)
• Allocation Type: Single-year Grants
• Review Section: Transformative Research Areas, Section (III)
• Research Institution: Tohoku University
• Principal Investigator: 水上 進 東北大学, 多元物質科学研究所, 教授 (30420433)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 藤原 敬宏 京都大学, 高等研究院, 特定准教授 (80423060)
• Project Period (FY): 2021-09-10 – 2026-03-31
• Project Status: Granted (Fiscal Year 2025)
• Budget Amount: ¥91,780,000 (Direct Cost: ¥70,600,000、Indirect Cost: ¥21,180,000); Fiscal Year 2025: ¥16,770,000 (Direct Cost: ¥12,900,000、Indirect Cost: ¥3,870,000); Fiscal Year 2024: ¥17,030,000 (Direct Cost: ¥13,100,000、Indirect Cost: ¥3,930,000); Fiscal Year 2023: ¥16,640,000 (Direct Cost: ¥12,800,000、Indirect Cost: ¥3,840,000); Fiscal Year 2022: ¥17,030,000 (Direct Cost: ¥13,100,000、Indirect Cost: ¥3,930,000); Fiscal Year 2021: ¥24,310,000 (Direct Cost: ¥18,700,000、Indirect Cost: ¥5,610,000)
• Keywords: クロススケール / マルチ計測 / 1分子超解像イメージング / 細胞内標識

Outline of Research at the Start

本課題では、高機能性プローブ開発と先端光学技術を組み合わせることにより、細胞内分子・構造体を様々な空間・時間スケールで可視化するための基盤技術を開発する。具体的には、化学プローブ設計による細胞内分子および化学環境の可視化技術、汎用可能な細胞内分子修飾プラットフォーム技術、1分子超解像ライブイメージング技術、の三つを開発する。いずれの技術も領域内の各班に提供し、共同研究により細胞内分子および構造体の機能・構造・動態の相関を明らかにする。

Outline of Annual Research Achievements

課題①の細胞内局所環境を可視化するプローブ技術の開発については、前年度までに開発した局在型pH蛍光プローブを用いて、マイトファジーの可視化に取り組んだ。HaloTag蛋白質をミトコンドリアのマトリクスに発現させて、pH蛍光プローブをミトコンドリア内に局在化させた後、薬剤によりマイトファジーを誘導した。レシオ蛍光イメージングにより、マイトファジーによるミトコンドリア内pHの酸性化の可視化に成功した。
課題②のマルチ計測・制御プラットフォーム技術の開発については、標的の細胞内標的蛋白質に対して蛋白質ラベル化技術と細胞内クリックケミストリーを利用して二種類の機能性分子（蛍光色素と電子顕微鏡で観察可能な構造体）を修飾するための分子モジュールを合成した。また、低分子が結合する蛋白質モジュールのプラスミド設計および蛋白質の精製を行った。低分子モジュールの構築が完了し次第、低分子-蛋白質複合体を形成し、電子顕微鏡で観察する予定である。
課題③の高速１分子超解像イメージング技術の開発については、ブリンキングプローブの誘導体化を行った。新たに開発したブリンキングプローブの酸解離定数（pKcycl）、1分子ブリンキング特性を評価し、化合物構造との相関を調べた。さらに、生細胞標識方法の最適化とアクチン細胞骨格の高速1分子超解像イメージングへの応用を進めた。福間班との共同研究では、In-cell AFMと全反射蛍光顕微鏡の複合機を立ち上げ、接着斑の形成動態研究のための技術開発を進めた。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

概ね当初の予定通りに研究計画が進行している。

Strategy for Future Research Activity

課題①の細胞内局所環境を可視化するプローブ技術の開発については、本年度開発した細胞内局在が可能なpH蛍光プローブを用いて 、pH変化を伴う様々な細胞内現象を可視化する。具体的には、オートファジーに着目し、領域内研究者と共同してpH変化を引き起こす前のオートファジーの進行過程を可視化する。
課題②のマルチ計測・制御プラットフォーム技術の開発については、引き続き標的の細胞内標的蛋白質に対して蛋白質ラベル化技術と細胞内クリックケミストリーを利用して蛍光色素と電子顕微鏡で観察可能な構造体を修飾するための分子モジュールを開発する。
課題③の高速１分子超解像イメージング技術の開発については、超高速１分子観察の結果をもとに引き続きプローブ改良を行う。また、秒オーダーの高速1分子超解像画像を取得し、細胞内の様々なスケールのメゾ複雑体の構造・動態・機能の相関を明らかにする。In-cell AFM－全反射蛍光顕微鏡複合機での技術的問題 (蛍光褪色等)を解決し、1分子イメージングとの複合化に発展させる。

Research Products

• [Journal Article] Arylazopyrazole-Based Photoswitchable Inhibitors Selective for Escherichia coli Dihydrofolate Reductase (2023)
  • Author(s): Himadri S. Sarkar, Takato Mashita, Toshiyuki Kowada, Satoshi Hamaguchi, Toshizo Sato, Kento Kasahara, Nobuyuki Matubayasi, Toshitaka Matsui, and Shin Mizukami*
  • Journal Title: ACS Chem. Biol. Volume: 18 Issue: 2 Pages: 340-346
  • DOI: 10.1021/acschembio.2c00749
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Development of Photoresponsive Probes to Investigate Cellular Functions (2022)
  • Author(s): 水上 進
  • Journal Title: YAKUGAKU ZASSHI Volume: 142 Issue: 5 Pages: 503-511
  • DOI: 10.1248/yakushi.21-00203-4
  • ISSN: 0031-6903, 1347-5231
  • Year and Date: 2022-05-01
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Clip to Click: Controlling Inverse Electron-Demand Diels窶鄭lder Reactions with Macrocyclic Tetrazines (2022)
  • Author(s): Ira Novianti, Toshiyuki Kowada, and Shin Mizukami*
  • Journal Title: Org. Lett. Volume: 24 Issue: 17 Pages: 3223-3226
  • DOI: 10.1021/acs.orglett.2c01010
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Quantitative and Repetitive Control of Subcellular Protein窶撤rotein Interaction Using a Photochromic Dimerizer (2022)
  • Author(s): Takato Mashita, Toshiyuki Kowada, Hayashi Yamamoto, Satoshi Hamaguchi, Toshitaka Matsui, Shin Mizukami
  • Journal Title: ChemRxiv Volume: 巻号無し
  • DOI: 10.26434/chemrxiv-2022-7vq8s-v2
  • Open Access
• [Journal Article] A highly photostable and bright green fluorescent protein (2022)
  • Author(s): Hirano Masahiko、Ando Ryoko、Shimozono Satoshi、Sugiyama Mayu、Takeda Noriyo、Kurokawa Hiroshi、Deguchi Ryusaku、Endo Kazuki、Haga Kei、Takai-Todaka Reiko、Inaura Shunsuke、Matsumura Yuta、Hama Hiroshi、Okada Yasushi、Fujiwara Takahiro、Morimoto Takuya、Katayama Kazuhiko、Miyawaki Atsushi
  • Journal Title: Nature Biotechnology Volume: - Issue: 7 Pages: 1132-1142
  • DOI: 10.1038/s41587-022-01278-2
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] A methodology for creating mutants of G‐protein coupled receptors stabilized in active state by combining statistical thermodynamics and evolutionary molecular engineering (2022)
  • Author(s): Yamamoto Taisei、Yasuda Satoshi、Kasai Rinshi S.、Nakano Ryosuke、Hikiri Simon、Sugaya Kanna、Hayashi Tomohiko、Ogasawara Satoshi、Shiroishi Mitsunori、Fujiwara Takahiro K.、Kinoshita Masahiro、Murata Takeshi
  • Journal Title: Protein Science Volume: 31 Issue: 10
  • DOI: 10.1002/pro.4425
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] Organelle-Level Labile Zn²⁺ Mapping Based on Targetable Fluorescent Sensors (2022)
  • Author(s): Liu Rong、Kowada Toshiyuki、Du Yuyin、Amagai Yuta、Matsui Toshitaka、Inaba Kenji、Mizukami Shin
  • Journal Title: ACS Sensors Volume: 7 Issue: 3 Pages: 748-757
  • DOI: 10.1021/acssensors.1c02153
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Fluorescent Probes for the Quantification of Labile Metal Ions in Living Cells (2021)
  • Author(s): Kowada Toshiyuki、Mizukami Shin
  • Journal Title: Journal of Synthetic Organic Chemistry, Japan Volume: 79 Issue: 11 Pages: 1020-1032
  • DOI: 10.5059/yukigoseikyokaishi.79.1020
  • NAID: 130008114811
  • ISSN: 0037-9980, 1883-6526
  • Year and Date: 2021-11-01
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Optical Manipulation of Subcellular Protein Translocation Using a Photoactivatable Covalent Labeling System (2021)
  • Author(s): Kowada Toshiyuki、Arai Keisuke、Yoshimura Akimasa、Matsui Toshitaka、Kikuchi Kazuya、Mizukami Shin
  • Journal Title: Angewandte Chemie International Edition Volume: 60 Issue: 20 Pages: 11378-11383
  • DOI: 10.1002/anie.202016684
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Single-Molecule Imaging Reveals Rapid Estradiol Action on the Surface Movement of AMPA Receptors in Live Neurons (2021)
  • Author(s): Soma Godo, Klaudia Barabas, Ferenc Lengyel, David Ernszt, Tamas Kovacs, Miklos Kecskes, Csaba Varga, Tibor Z. Janosi, Geza Makkai, Gergely Kovacs, Barbara Orsolits, Takahiro Fujiwara, Akihiro Kusumi, Istvan M. Abraham
  • Journal Title: Front. Cell Dev. Biol. Volume: 9 Pages: 708715-708715
  • DOI: 10.3389/fcell.2021.708715
  • Peer Reviewed / Int'l Joint Research
• [Journal Article] Extracellular vesicles synchronize cellular phenotypes of differentiating cells (2021)
  • Author(s): Tomohiro Minakawa, Tetsuya Matoba, Fumiyoshi Ishidate, Takahiro K. Fujiwara, Sho Takehana, Yasuhiko Tabata, Jun Yamashita
  • Journal Title: J. Extracell. Vesicles Volume: 10 Issue: 11
  • DOI: 10.1002/jev2.12147
  • Peer Reviewed
• [Presentation] フォトクロミック蛋白質二量化剤を用いた生細胞内蛋白質局在の光制御 (2023)
  • Author(s): 佐藤 歳三,小和田 俊行,濱口 聡志,松井 敏高,水上 進
  • Organizer: 日本化学会 第103春季年会 (2023)
• [Presentation] タグ融合蛋白質の細胞内分解を光制御する機能性化合物の開発 (2023)
  • Author(s): 松尾 章弘,小和田 俊行,Himadri Sarkar,松井 敏高,水上 進
  • Organizer: 日本化学会 第103春季年会
• [Presentation] Activatable Click Reactions with Macrocyclic Tetrazines (2022)
  • Author(s): Ira Novianti,Toshiyuki Kowada,Shin Mizukami
  • Organizer: 第22回東北大学多元物質科学研究所研究発表会
• [Presentation] Visualization and control of live cell functions by integrating organic chemistry and light (2022)
  • Author(s): 水上 進
  • Organizer: 東京大学理学系研究科化学専攻雑誌会セミナー
  • Invited
• [Presentation] Quantitative Mapping of Subcellular Labile Zn2+ Concentrations Using Localizable Small-Molecule Fluorescent Probes (2022)
  • Author(s): Rong Liu,Toshiyuki Kowada,Toshitaka Matsui,Shin Mizukami
  • Organizer: 10th Asian Biological Inorganic Chemistry Conference (AsBIC10)
  • Int'l Joint Research
• [Presentation] Time-Lapse Ratiometric Imaging of Mitochondrial pH during Mitophagy Using a Localizable Fluorescent Probe (2022)
  • Author(s): Toshiyuki Kowada,Risa Ito,Makoto Iwashita,Toshitaka Matsui,Shin Mizukami
  • Organizer: 10th Asian Biological Inorganic Chemistry Conference (AsBIC10)
  • Int'l Joint Research
• [Presentation] 光可逆的蛋白質ラベル化システムによる 細胞内蛋白質動態と細胞機能の光制御 (2022)
  • Author(s): 水上進
  • Organizer: 第60回日本生物物理学会年会 シンポジウム「細胞内メゾ複雑体の構造と機能」
  • Invited
• [Presentation] 光可逆的かつ定量的なタンパク質ラベル化を可能とするフォトクロミックリガンドの開発 (2022)
  • Author(s): 浜口聡志,小和田俊行,間下貴斗,Himadri S. SARKAR,松井敏高,水上 進
  • Organizer: 第16回バイオ関連化学シンポジウム
• [Presentation] 光可逆的蛋白質ラベル化法に基づく細胞内蛋白質局在の光制御 (2022)
  • Author(s): 小和田俊行,間下貴斗,山本 林,松井敏高,水上進
  • Organizer: クロススケール新生物学 第２回領域会議
• [Presentation] 細胞内分子の構造;動態;機能相関を調べるためのクロススケール可視化制御技術の開発 (2022)
  • Author(s): 水上進
  • Organizer: 学術変革領域研究（A）クロススケール新生物学 第2回領域会議
• [Presentation] 光可逆的蛋白質ラベル化法に基づく細胞内蛋白質局在の光制御（口頭O-09） (2022)
  • Author(s): 小和田俊行,間下貴斗,山本 林,松井敏高,水上進
  • Organizer: 第16回日本分子イメージング学会学術集会
• [Presentation] 光可逆的タンパク質ラベリング技術の開発 (2022)
  • Author(s): 濵口聡志,間下貴斗,小和田敏行,松井敏高,水上進
  • Organizer: 第33回万有仙台シンポジウム三地区交流ミニセミナー
• [Presentation] 局在型レシオ蛍光プローブを用いた細胞内局所pHの定量イメージング (2022)
  • Author(s): 岩下 誠,小和田俊行,伊藤理紗,松井敏高,水上 進
  • Organizer: 日本化学会第102春季年会
• [Presentation] 光可逆的タンパク質ラベル化技術を利用したタンパク質局在の光制御 (2022)
  • Author(s): 間下 貴斗,小和田 俊行,松井 敏高,水上 進
  • Organizer: 日本化学会 第102春季年会
• [Presentation] Controlling IEDDA Reaction with Macrocyclic Tetrazine (2022)
  • Author(s): Ira Novianti,Toshiyuki Kowada,Shin Mizukami
  • Organizer: 日本化学会第102春季年会
• [Presentation] 生体分子機能の定量的光制御を可能とする生体解析基盤技術の開発 (2022)
  • Author(s): 水上 進
  • Organizer: 中谷医工計測技術振興財団 令和元年度特別研究助成成果報告
• [Presentation] 細胞内 pH 変化のリアルタイムイメージング用蛍光プローブの開発 (2021)
  • Author(s): 岩下 誠,小和田俊行,伊藤理紗,松井敏高,水上 進
  • Organizer: 令和3年度多元研発表会
• [Presentation] Development of a chemical biology tool enabling reversible optical control of protein labeling (2021)
  • Author(s): Himadri Sekhar Sarkar,Takato Mashita,Toshiyuki Kowada,Toshitaka Matsui,Shin Mizukami
  • Organizer: The 10th Annual Conference Of The International Chemical Biology Society (ICBS2021)
  • Int'l Joint Research
• [Presentation] 細胞小器官内遊離Zn2+の濃度定量と動態観察を可能とする小分子蛍光プローブの開発 (2021)
  • Author(s): 小和田俊行,劉 熔,杜 雨音,松井敏高,水上 進
  • Organizer: 第15回バイオ関連化学シンポジウム
• [Presentation] Quantitative imaging of labile Zn2+ using organelle-localizable fluorescent probes (2021)
  • Author(s): Rong Liu,Toshiyuki Kowada,Toshitaka Matsui,Shin Mizukami
  • Organizer: 第15回日本分子イメージング学会学術集会
• [Presentation] 共有結合型蛋白質ラベル化技術を利用した細胞内蛋白質二量化の光制御 (2021)
  • Author(s): 小和田俊行,荒井啓介,吉村彰真,松井敏高,菊地和也,水上進
  • Organizer: 第15回日本分子イメージング学会学術集会
• [Presentation] Visualization and quantification of labile Zn2+ in the acidic subcellular compartments using a small-molecule fluorescent probe (2021)
  • Author(s): Yuyin Du,Rong Liu,小和田 俊行,松井 敏高,門倉 広,稲葉 謙次,水上 進
  • Organizer: 第32回万有仙台シンポジウム
• [Presentation] 細胞内分子の構造・動態・機能相関を調べるための クロススケール可視化制御技術の開発 (2021)
  • Author(s): 水上進
  • Organizer: 学術変革領域研究（A）「クロススケール新生物学」 キックオフミーティング
• [Presentation] Development of fluorescent probes for visualizing Zn2+/H+ dynamics in living cells (2021)
  • Author(s): 小和田俊行,松井敏高,水上 進
  • Organizer: 学術変革領域（A）クロススケール新?物学 第一回領域会議
• [Presentation] Development of photo-reversible protein labeling system (2021)
  • Author(s): Takato Mashita,Toshiyuki Kowada,Toshitaka Matsui,Shin Mizukami
  • Organizer: 学術変革領域(A)クロススケール新生物学 第一回領域会議
• [Presentation] Development of novel fluorescent probes for detection of extracellular sulfatases (2021)
  • Author(s): Yi Ding,Kashfia Ahamed,Toshiyuki Kowada,Norihiko Sasaki,Toshitaka Matsui,Shin Mizukami
  • Organizer: 第21回東北大学多元物質科学研究所研究発表会
• [Presentation] Unraveling mesoscopic organization of the plasma membrane by ultrafast single fluorescent-molecule tracking and localization microscopy (2021)
  • Author(s): Takahiro Fujiwara
  • Organizer: 金沢大学ナノ生命科学研究所 「NanoLSI Open Seminar」
• [Book] 先端の分析法 第2版 (澤田嗣郎 監修 第4章 第3節4項) (2022)
  • Author(s): 藤原敬宏
  • Total Pages: 1072
  • Publisher: エヌ・ティー・エス
  • ISBN: 9784860437374
• [Book] Live Cell Imaging: Methods and Protocols, Methods in Molecular Biology, vol 2274, Eds by Sung-Bae Kim (Chapter 20) (2021)
  • Author(s): Priya Ranjan Sahoo, Toshiyuki Kowada, Shin Mizukami
  • Total Pages: 7
  • Publisher: Springer
  • ISBN: 9781071612576
• [Remarks] 水上研究室 東北大学多元物質科学研究所
  • URL: http://www2.tagen.tohoku.ac.jp/lab/mizukami/
• [Remarks] 水上研究室 東北大学多元物質科学研究所
  • URL: http://www2.tagen.tohoku.ac.jp/lab/mizukami/
• [Patent(Industrial Property Rights)] 外部刺激応答性クリック反応技術 (2021)
  • Inventor(s): 水上進，イラノヴィアンティ，小和田俊行
  • Industrial Property Rights Holder: 国立大学法人 東北大学
  • Industrial Property Rights Type: 特許
  • Filing Date: 2021
  • Overseas