Development of cross-scale technologies for investigating correlations of structures, dynamics, and functions of intracellular molecules

• Project Area: New cross-scale biology
• Project/Area Number: 21H05252
• Research Category: Grant-in-Aid for Transformative Research Areas (A)
• Allocation Type: Single-year Grants
• Review Section: Transformative Research Areas, Section (III)
• Research Institution: Tohoku University
• Principal Investigator: 水上 進 東北大学, 多元物質科学研究所, 教授 (30420433)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 藤原 敬宏 京都大学, 高等研究院, 特定准教授 (80423060)
• Project Period (FY): 2021-09-10 – 2026-03-31
• Project Status: Granted (Fiscal Year 2025)
• Budget Amount: ¥91,780,000 (Direct Cost: ¥70,600,000、Indirect Cost: ¥21,180,000); Fiscal Year 2025: ¥16,770,000 (Direct Cost: ¥12,900,000、Indirect Cost: ¥3,870,000); Fiscal Year 2024: ¥17,030,000 (Direct Cost: ¥13,100,000、Indirect Cost: ¥3,930,000); Fiscal Year 2023: ¥16,640,000 (Direct Cost: ¥12,800,000、Indirect Cost: ¥3,840,000); Fiscal Year 2022: ¥17,030,000 (Direct Cost: ¥13,100,000、Indirect Cost: ¥3,930,000); Fiscal Year 2021: ¥24,310,000 (Direct Cost: ¥18,700,000、Indirect Cost: ¥5,610,000)
• Keywords: クロススケール / マルチ計測 / 1分子超解像イメージング / 細胞内標識

Outline of Research at the Start

本課題では、高機能性プローブ開発と先端光学技術を組み合わせることにより、細胞内分子・構造体を様々な空間・時間スケールで可視化するための基盤技術を開発する。具体的には、化学プローブ設計による細胞内分子および化学環境の可視化技術、汎用可能な細胞内分子修飾プラットフォーム技術、1分子超解像ライブイメージング技術、の三つを開発する。いずれの技術も領域内の各班に提供し、共同研究により細胞内分子および構造体の機能・構造・動態の相関を明らかにする。

Outline of Annual Research Achievements

本年度は課題②および③について検討を行った。
課題②のマルチ計測・制御プラットフォーム技術の開発については、HaloTagを有する細胞内標的蛋白質に対して、電子顕微鏡で識別可能な金ナノ粒子複合体を細胞内修飾する技術の開発を行った。合成した機能性分子は、一つはHaloTagリガンドと2つのテトラジンを有する化合物１であり、もう一つはSNAP-tagリガンドとtrans-シクロオクテン（ＴＣＯ）を連結した化合物２である。化合物は細胞内においてHaloTag融合蛋白質に対し2つのテトラジンを修飾する。そこに化合物２を添加すると、IEDDA反応を経由して2分子のSNAP-tagリガンドを修飾できる。細胞内にSNAP-tagと複数のメタロチオネインをを含む融合蛋白質を発現させることで、標的蛋白質を複数のメタロチオネインで修飾することが可能になる。メタロチオネイン上で金ナノ粒子を形成させることで、標的蛋白質を電子顕微鏡観察で認識することが可能になる。本年度はこれらの分子モジュールの合成、蛋白質モジュールのプラスミド作成を完了し、試験管内での金ナノ粒子複合体の形成を電子顕微鏡により評価した。
課題③の高速１分子超解像イメージング技術の開発については、アミノメチル基を有するSiローダミン色素のブリンキング特性の解析から、アミノ基のα位の置換基の嵩高さを制御することで、適度な開環－閉環速度定数を有するブリンキング色素の分子設計が可能であることを示した。また、開発したブリンキング色素の一つを用いて、ミトコンドリア形態の1分子超解像イメージングを行い、秒スケールでの生細胞超解像イメージングに成功した。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

概ね当初の予定通りに研究計画が進行している。

Strategy for Future Research Activity

課題①の細胞内局所環境を可視化するプローブ技術の開発については、pH変化を伴う様々な細胞内現象を可視化する。具体的には、オートファジーに着目し、領域内研究者と共同してpH変化を引き起こす前のオートファジーの進行過程を可視化する。
課題②のマルチ計測・制御プラットフォーム技術の開発については、引き続き標的の細胞内標的蛋白質に対して蛋白質ラベル化技術と細胞内クリックケミストリーを用いて電子顕微鏡と蛍光顕微鏡での同一サンプルの可視化を目指す。
課題③の高速１分子超解像イメージング技術の開発については、秒オーダーの高速1分子超解像画像取得に成功したものの、蛍光色素の光安定性に問題が見られたことから、この問題を解決するような新たな1分子超解像イメージング技術の開発につなげる。

Research Products

• [Journal Article] Long-term imaging of intranuclear Mg²⁺ dynamics during mitosis using a localized fluorescent probe (2023)
  • Author(s): Matsui Yusuke、Kowada Toshiyuki、Ding Yi、Sahoo Priya Ranjan、Kikuchi Kazuya、Mizukami Shin
  • Journal Title: Chemical Communications Volume: 59 Pages: 7048～7051
  • DOI: 10.1039/d2cc05930d
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] Zinc homeostasis governed by Golgi-resident ZnT family members regulates ERp44-mediated proteostasis at the ER-Golgi interface (2023)
  • Author(s): Amagai Yuta、Yamada Momo、Kowada Toshiyuki、Watanabe Tomomi、Du Yuyin、Liu Rong、Naramoto Satoshi、Watanabe Satoshi、Kyozuka Junko、Anelli Tiziana、Tempio Tiziana、Sitia Roberto、Mizukami Shin、Inaba Kenji
  • Journal Title: Nature Communications Volume: 14 Pages: 2683
  • DOI: 10.1038/s41467-023-38397-6
  • Peer Reviewed / Open Access / Int'l Joint Research
• [Journal Article] Arylazopyrazole-Based Photoswitchable Inhibitors Selective for Escherichia coli Dihydrofolate Reductase (2023)
  • Author(s): Himadri S. Sarkar, Takato Mashita, Toshiyuki Kowada, Satoshi Hamaguchi, Toshizo Sato, Kento Kasahara, Nobuyuki Matubayasi, Toshitaka Matsui, and Shin Mizukami*
  • Journal Title: ACS Chem. Biol. Volume: 18 Pages: 340-346
  • DOI: 10.1021/acschembio.2c00749
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Clip to Click: Controlling Inverse Electron-Demand Diels?Alder Reactions with Macrocyclic Tetrazines (2022)
  • Author(s): Ira Novianti, Toshiyuki Kowada, and Shin Mizukami*
  • Journal Title: Org. Lett. Volume: 24 Pages: 3223-3226
  • DOI: 10.1021/acs.orglett.2c01010
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] 細胞機能を探索するための光応答性プローブの開発 (2022)
  • Author(s): 水上 進
  • Journal Title: 薬学雑誌 Volume: 142 Pages: 503-511
  • DOI: 10.1248/yakushi.21-00203-4
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Quantitative and Repetitive Control of Subcellular Protein?Protein Interaction Using a Photochromic Dimerizer (2022)
  • Author(s): Takato Mashita, Toshiyuki Kowada, Hayashi Yamamoto, Satoshi Hamaguchi, Toshitaka Matsui, Shin Mizukami
  • Journal Title: ChemRxiv Volume: 巻号無し Pages: 頁番号無し
  • DOI: 10.26434/chemrxiv-2022-7vq8s-v2
  • Open Access
• [Journal Article] A highly photostable and bright green fluorescent protein (2022)
  • Author(s): Masahiko Hirano, Ryoko Ando, Satoshi Shimozono, Mayu Sugiyama, Noriyo Takeda, Hiroshi Kurokawa, Ryusaku Deguchi, Kazuki Endo, Kei Haga, Reiko Takai-Todaka, Shunsuke Inaura, Yuta Matsumura, Hiroshi Hama, Yasushi Okada, Takahiro Fujiwara, Takuya Morimoto, Kazuhiko Katayama, Atsushi Miyawaki
  • Journal Title: Nat. Biotechnol. Volume: 40 Pages: 1132-1142
  • DOI: 10.1038/s41587-022-01278-2
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] A methodology for creating mutants of G‐protein coupled receptors stabilized in active state by combining statistical thermodynamics and evolutionary molecular engineering (2022)
  • Author(s): Taisei Yamamoto, Satoshi Yasuda, Rinshi S. Kasai, Ryosuke Nakano, Simon Hikiri, Kanna Sugaya, Tomohiko Hayashi, Satoshi Ogasawara, Mitsunori Shiroishi, Takahiro K. Fujiwara, Masahiro Kinoshita, Takeshi Murata
  • Journal Title: Protein Sci. Volume: 3 Pages: e4425
  • DOI: 10.1002/pro.4425
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Organelle-Level Labile Zn2+ Mapping Based on Targetable Fluorescent Sensors (2022)
  • Author(s): Rong Liu, Toshiyuki Kowada, Yuyin Du, Yuta Amagai, Toshitaka Matsui, Kenji Inaba, Shin Mizukami
  • Journal Title: ACS Sens. Volume: 7 Pages: 748-757
  • DOI: 10.1021/acssensors.1c02153
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Fluorescent Probes for the Quantification of Labile Metal Ions in Living Cells (2021)
  • Author(s): Toshiyuki Kowada, Shin Mizukami
  • Journal Title: J. Synth. Org. Chem. Jpn. Volume: 79 Pages: 1020-1032
  • DOI: 10.5059/yukigoseikyokaishi.79.1020
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Optical manipulation of subcellular protein translocation using a photoactivatable covalent labeling system (2021)
  • Author(s): Toshiyuki Kowada, Keisuke Arai, Akimasa Yoshimura, Toshitaka Matsui, Kazuya Kikuchi, Shin Mizukami
  • Journal Title: Angew. Chem. Int. Ed. Volume: 60 Pages: 11378-11383
  • DOI: 10.1002/anie.202016684
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Single-Molecule Imaging Reveals Rapid Estradiol Action on the Surface Movement of AMPA Receptors in Live Neurons (2021)
  • Author(s): Soma Godo, Klaudia Barabas, Ferenc Lengyel, David Ernszt, Tamas Kovacs, Miklos Kecskes, Csaba Varga, Tibor Z. Janosi, Geza Makkai, Gergely Kovacs, Barbara Orsolits, Takahiro Fujiwara, Akihiro Kusumi, Istvan M. Abraham
  • Journal Title: Front. Cell Dev. Biol. Volume: 9 Pages: 708715
  • DOI: 10.3389/fcell.2021.708715
  • Peer Reviewed / Int'l Joint Research
• [Journal Article] Extracellular vesicles synchronize cellular phenotypes of differentiating cells (2021)
  • Author(s): Tomohiro Minakawa, Tetsuya Matoba, Fumiyoshi Ishidate, Takahiro K. Fujiwara, Sho Takehana, Yasuhiko Tabata, Jun Yamashita
  • Journal Title: J. Extracell. Vesicles Volume: 10 Pages: e12147
  • DOI: 10.1002/jev2.12147
  • Peer Reviewed
• [Presentation] Development of an optochemical tool controlling the formation of mitochondria and endoplasmic reticulum contact sites (2023)
  • Author(s): Quan Minh Duong, Toshiyuki Kowada, Shin Mizukami
  • Organizer: 日本ケミカルバイオロジー学会 第17回年会
• [Presentation] アゾピラゾール骨格を用いたフォトクロミック蛋白質二量化剤の開発と細胞内蛋白質局在の光制御 (2023)
  • Author(s): 佐藤 歳三, 小和田 俊行, 間下 貴斗, 濱口 聡志, 松井 敏高, 水上 進
  • Organizer: 第17回日本分子イメージング学会学術集会
• [Presentation] Quantitative imaging of subcellular Zn2+ using localizable small-molecule fluorescent probes (2023)
  • Author(s): Rong Liu, Toshiyuki Kowada, Shin Mizukami
  • Organizer: Tohoku University 2023 Chemistry Summer School
  • Int'l Joint Research
• [Presentation] Development of an optochemical tool controlling the formation and dissociation of mitochondria and endoplasmic reticulum contact sites (2023)
  • Author(s): Quan Minh Duong, Toshiyuki Kowada, Shin Mizukami
  • Organizer: Tohoku University 2023 Chemistry Summer School
• [Presentation] Development of localizable small-molecule fluorescent probes for quantitatively studying chemical proteostasis (2023)
  • Author(s): Shin Mizukami
  • Organizer: 第96回日本生化学会大会
  • Invited
• [Presentation] Development of fast-blinking fluorophores for real-time single-molecule super-resolution imaging (2023)
  • Author(s): Bochao Li, Toshiyuki Kowada, Takahiro Fujiwara, Shin Mizukami
  • Organizer: 第23回東北大学多元物質科学研究所研究発表会
• [Presentation] 電顕観察を指向したタンパク質会合技術による特異なタグ構造の構築 (2023)
  • Author(s): Ippei Takashima, Chieko Saito, Hayashi Yamamoto, Masahide Kikkawa, Shin Mizukami
  • Organizer: 学術変革領域（A）クロススケール新生物学 第三回領域会議
• [Presentation] 腫瘍イメージングのためのスルファターゼ 2活性検出蛍光プローブの開発 (2023)
  • Author(s): Yi Ding, Toshiyuki Kowada, Norihiko Sasaki, Toshitaka Matsui, Shin Mizukami
  • Organizer: 学術変革領域（A）クロススケール新生物学 第三回領域会議
• [Presentation] リアルタイム1分子超解像イメージングのための高速ブリンキング蛍光色素の開発 (2023)
  • Author(s): Bochao Li, Toshiyuki Kowada, Takahiro Fujiwara, Shin Mizukami
  • Organizer: 学術変革領域（A）クロススケール新生物学 第三回領域会議
• [Presentation] フォトクロミック蛋白質二量化剤を用いた生細胞内蛋白質局在の光制御 (2023)
  • Author(s): 佐藤 歳三,小和田 俊行,濱口 聡志,松井 敏高,水上 進
  • Organizer: 日本化学会 第103春季年会 (2023)
• [Presentation] タグ融合蛋白質の細胞内分解を光制御する機能性化合物の開発 (2023)
  • Author(s): 松尾 章弘,小和田 俊行,Himadri Sarkar,松井 敏高,水上 進
  • Organizer: 日本化学会 第103春季年会
• [Presentation] Activatable Click Reactions with Macrocyclic Tetrazines (2022)
  • Author(s): Ira Novianti,Toshiyuki Kowada,Shin Mizukami
  • Organizer: 第22回東北大学多元物質科学研究所研究発表会
• [Presentation] Visualization and control of live cell functions by integrating organic chemistry and light (2022)
  • Author(s): 水上 進
  • Organizer: 東京大学理学系研究科化学専攻雑誌会セミナー
  • Invited
• [Presentation] Quantitative Mapping of Subcellular Labile Zn2+ Concentrations Using Localizable Small-Molecule Fluorescent Probes (2022)
  • Author(s): Rong Liu,Toshiyuki Kowada,Toshitaka Matsui,Shin Mizukami
  • Organizer: 10th Asian Biological Inorganic Chemistry Conference (AsBIC10)
  • Int'l Joint Research
• [Presentation] Time-Lapse Ratiometric Imaging of Mitochondrial pH during Mitophagy Using a Localizable Fluorescent Probe (2022)
  • Author(s): Toshiyuki Kowada,Risa Ito,Makoto Iwashita,Toshitaka Matsui,Shin Mizukami
  • Organizer: 10th Asian Biological Inorganic Chemistry Conference (AsBIC10)
  • Int'l Joint Research
• [Presentation] 光可逆的蛋白質ラベル化システムによる 細胞内蛋白質動態と細胞機能の光制御 (2022)
  • Author(s): 水上進
  • Organizer: 第60回日本生物物理学会年会 シンポジウム「細胞内メゾ複雑体の構造と機能」
  • Invited
• [Presentation] 光可逆的かつ定量的なタンパク質ラベル化を可能とするフォトクロミックリガンドの開発 (2022)
  • Author(s): 浜口聡志,小和田俊行,間下貴斗,Himadri S. SARKAR,松井敏高,水上 進
  • Organizer: 第16回バイオ関連化学シンポジウム
• [Presentation] 光可逆的蛋白質ラベル化法に基づく細胞内蛋白質局在の光制御 (2022)
  • Author(s): 小和田俊行,間下貴斗,山本 林,松井敏高,水上進
  • Organizer: クロススケール新生物学 第２回領域会議
• [Presentation] 細胞内分子の構造;動態;機能相関を調べるためのクロススケール可視化制御技術の開発 (2022)
  • Author(s): 水上進
  • Organizer: 学術変革領域研究（A）クロススケール新生物学 第2回領域会議
• [Presentation] 光可逆的蛋白質ラベル化法に基づく細胞内蛋白質局在の光制御（口頭O-09） (2022)
  • Author(s): 小和田俊行,間下貴斗,山本 林,松井敏高,水上進
  • Organizer: 第16回日本分子イメージング学会学術集会
• [Presentation] 光可逆的タンパク質ラベリング技術の開発 (2022)
  • Author(s): 濵口聡志,間下貴斗,小和田敏行,松井敏高,水上進
  • Organizer: 第33回万有仙台シンポジウム三地区交流ミニセミナー
• [Presentation] 局在型レシオ蛍光プローブを用いた細胞内局所pHの定量イメージング (2022)
  • Author(s): 岩下 誠,小和田俊行,伊藤理紗,松井敏高,水上 進
  • Organizer: 日本化学会第102春季年会
• [Presentation] 光可逆的タンパク質ラベル化技術を利用したタンパク質局在の光制御 (2022)
  • Author(s): 間下 貴斗,小和田 俊行,松井 敏高,水上 進
  • Organizer: 日本化学会 第102春季年会
• [Presentation] Controlling IEDDA Reaction with Macrocyclic Tetrazine (2022)
  • Author(s): Ira Novianti,Toshiyuki Kowada,Shin Mizukami
  • Organizer: 日本化学会第102春季年会
• [Presentation] 生体分子機能の定量的光制御を可能とする生体解析基盤技術の開発 (2022)
  • Author(s): 水上 進
  • Organizer: 中谷医工計測技術振興財団 令和元年度特別研究助成成果報告
• [Presentation] 細胞内 pH 変化のリアルタイムイメージング用蛍光プローブの開発 (2021)
  • Author(s): 岩下 誠,小和田俊行,伊藤理紗,松井敏高,水上 進
  • Organizer: 令和3年度多元研発表会
• [Presentation] Development of a chemical biology tool enabling reversible optical control of protein labeling (2021)
  • Author(s): Himadri Sekhar Sarkar,Takato Mashita,Toshiyuki Kowada,Toshitaka Matsui,Shin Mizukami
  • Organizer: The 10th Annual Conference Of The International Chemical Biology Society (ICBS2021)
  • Int'l Joint Research
• [Presentation] 細胞小器官内遊離Zn2+の濃度定量と動態観察を可能とする小分子蛍光プローブの開発 (2021)
  • Author(s): 小和田俊行,劉 熔,杜 雨音,松井敏高,水上 進
  • Organizer: 第15回バイオ関連化学シンポジウム
• [Presentation] Quantitative imaging of labile Zn2+ using organelle-localizable fluorescent probes (2021)
  • Author(s): Rong Liu,Toshiyuki Kowada,Toshitaka Matsui,Shin Mizukami
  • Organizer: 第15回日本分子イメージング学会学術集会
• [Presentation] 共有結合型蛋白質ラベル化技術を利用した細胞内蛋白質二量化の光制御 (2021)
  • Author(s): 小和田俊行,荒井啓介,吉村彰真,松井敏高,菊地和也,水上進
  • Organizer: 第15回日本分子イメージング学会学術集会
• [Presentation] Visualization and quantification of labile Zn2+ in the acidic subcellular compartments using a small-molecule fluorescent probe (2021)
  • Author(s): Yuyin Du,Rong Liu,小和田 俊行,松井 敏高,門倉 広,稲葉 謙次,水上 進
  • Organizer: 第32回万有仙台シンポジウム
• [Presentation] 細胞内分子の構造・動態・機能相関を調べるための クロススケール可視化制御技術の開発 (2021)
  • Author(s): 水上進
  • Organizer: 学術変革領域研究（A）「クロススケール新生物学」 キックオフミーティング
• [Presentation] Development of fluorescent probes for visualizing Zn2+/H+ dynamics in living cells (2021)
  • Author(s): 小和田俊行,松井敏高,水上 進
  • Organizer: 学術変革領域（A）クロススケール新?物学 第一回領域会議
• [Presentation] Development of photo-reversible protein labeling system (2021)
  • Author(s): Takato Mashita,Toshiyuki Kowada,Toshitaka Matsui,Shin Mizukami
  • Organizer: 学術変革領域(A)クロススケール新生物学 第一回領域会議
• [Presentation] Development of novel fluorescent probes for detection of extracellular sulfatases (2021)
  • Author(s): Yi Ding,Kashfia Ahamed,Toshiyuki Kowada,Norihiko Sasaki,Toshitaka Matsui,Shin Mizukami
  • Organizer: 第21回東北大学多元物質科学研究所研究発表会
• [Presentation] Unraveling mesoscopic organization of the plasma membrane by ultrafast single fluorescent-molecule tracking and localization microscopy (2021)
  • Author(s): Takahiro Fujiwara
  • Organizer: 金沢大学ナノ生命科学研究所 「NanoLSI Open Seminar」
• [Book] Fluorescent Chemosensors （Chapter 12: Subcellular Compartment-targeting Fluorescent Zn2+ Probes) (2023)
  • Author(s): Toshiyuki Kowada, Shin Mizukami
  • Total Pages: 12
  • Publisher: Royal Society of Chemistry
  • ISBN: 9781839167324
• [Book] 先端の分析法 第2版 (澤田嗣郎 監修 第4章 第3節4項) (2022)
  • Author(s): 藤原敬宏
  • Total Pages: 1072
  • Publisher: エヌ・ティー・エス
  • ISBN: 978-4-86043-737-4
• [Book] Live Cell Imaging: Methods and Protocols, Methods in Molecular Biology, vol 2274, Eds by Sung-Bae Kim (Chapter 20) (2021)
  • Author(s): Priya Ranjan Sahoo, Toshiyuki Kowada, Shin Mizukami
  • Total Pages: 7
  • Publisher: Springer
  • ISBN: 978-1-0716-1257-6
• [Remarks] 水上研究室 東北大学多元物質科学研究所
  • URL: http://www2.tagen.tohoku.ac.jp/lab/mizukami/
• [Remarks] 水上研究室 東北大学多元物質科学研究所
  • URL: http://www2.tagen.tohoku.ac.jp/lab/mizukami/
• [Patent(Industrial Property Rights)] 外部刺激応答性クリック反応技術 (2021)
  • Inventor(s): 水上進，イラノヴィアンティ，小和田俊行
  • Industrial Property Rights Holder: 国立大学法人 東北大学
  • Industrial Property Rights Type: 特許
  • Industrial Property Number: PCT/JP2021/040154
  • Overseas