クロススケール細胞内分子構造動態解析が解明する細胞骨格ネットワーク構築とその破綻

• Project Area: New cross-scale biology
• Project/Area Number: 21H05254
• Research Category: Grant-in-Aid for Transformative Research Areas (A)
• Allocation Type: Single-year Grants
• Review Section: Transformative Research Areas, Section (III)
• Research Institution: Kobe University
• Principal Investigator: 仁田 亮 神戸大学, 医学研究科, 教授 (40345038)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 中田 隆夫 東京医科歯科大学, 大学院医歯学総合研究科, 教授 (50218004) ; 佐藤 繭子 国立研究開発法人理化学研究所, 環境資源科学研究センター, 技師 (80550376)
• Project Period (FY): 2021-09-10 – 2026-03-31
• Project Status: Granted (Fiscal Year 2024)
• Budget Amount: ¥118,820,000 (Direct Cost: ¥91,400,000、Indirect Cost: ¥27,420,000); Fiscal Year 2025: ¥21,190,000 (Direct Cost: ¥16,300,000、Indirect Cost: ¥4,890,000); Fiscal Year 2024: ¥21,320,000 (Direct Cost: ¥16,400,000、Indirect Cost: ¥4,920,000); Fiscal Year 2023: ¥20,930,000 (Direct Cost: ¥16,100,000、Indirect Cost: ¥4,830,000); Fiscal Year 2022: ¥21,320,000 (Direct Cost: ¥16,400,000、Indirect Cost: ¥4,920,000); Fiscal Year 2021: ¥34,060,000 (Direct Cost: ¥26,200,000、Indirect Cost: ¥7,860,000)
• Keywords: クロススケール解析 / クライオ電子顕微鏡 / 微小管 / アクチン / ラミン / クロススケール新生物学 / 細胞骨格 / 光遺伝学

Outline of Research at the Start

学術変革領域「クロススケール新生物学」の中で、本グループは細胞骨格ネットワーク構築とその破綻による疾病発症の分子機構を解明する。本領域で創設されるクロススケール細胞計測センターを活用して、細胞内で細胞骨格の種＝メゾ複雑体ができるタイミング・場所を超解像標識技術で同定し、クライオETで高分解能構造を、In-cell AFMで構造動画を記録する。メゾ複雑体内部の分子間相互作用をIn-cell NMRで測定し、これら構造・動態・相互作用情報を計算技術で統合して、細胞骨格ネットワーク構築過程を原子レベルで理解する。また医学応用を見据え、個体まで拡張したクロススケール技術およびヒト化応用技術を開発する。

Outline of Annual Research Achievements

学術変革領域「クロススケール新生物学」の中で、本グループは細胞骨格ネットワーク構築とその破綻による疾病発症の分子機構を解明する。
1)非中心体性微小管ネットワーク形成の分子機構を解明するため、微小管ネットワーク形成過程を高速動画として捉えるため原子間力顕微鏡による解析を、また原子分解能構造として捉えるためにクライオ電子顕微鏡単粒子解析法を用いた解析を行ない、順調にデータを取得した。現在、論文執筆へ向けた準備中である。 また、CAMSAPによる微小管ネットワーク形成過程を可視化すべく、クライオ電子線トモグラフィー法の整備をHeLa細胞やiPS心筋細胞などを用いて進めている。GFP-CAMSAP2を内因性CAMSAP2の遺伝子座にノックインし、安定発現系を構築中で、合わせてCryo電子線トモグラフィー撮影のためのCryo-CLEMやFIB-SEMの実験系の構築も継続して進めている。
2)光遺伝学によるタイムラプスクライオEM技術の開発:COS-7細胞を用いたタイムラプスクライオEM画像の取得が終わり、現在論文執筆中である。また、海馬初代培養細胞で 同様の系を構築し、クライオ電子線トモグラフィー撮影を行っている。
3) 分子から個体のクロススケール解析法の開発―医学応用へ:拡張型心筋症の高圧凍結・凍結置換電子顕微鏡解析の結果をScience Advance誌に報告した。また、拡張型心筋症患者由来のiPS心筋細胞のクライオ電子線トモグラフィーデータ取得のため、FIB-SEMによる試料菲薄化の条件検討を行っている。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

微小管課題は、単粒子解析および原子間力顕微鏡解析が終わり論文準備中、Actin課題は論文執筆中、拡張型心筋症（Lamin）課題はScience Advance誌に結果を報告し、予定通りに進展している。

Strategy for Future Research Activity

微小管課題は、HeLa細胞とiPS心筋細胞を用いたクライオ電子線トモグラフィー構造解析へと進むべく、GFP-CAMSAP2のノックインを進め、超解像顕微鏡で時系列データを取得するとともに、凍結条件の検討、Cryo- CLEMへと進める。
Actin課題は、データをまとめて論文掲載を目指す。
拡張型心筋症(Lamin)課題は、引き続き、患者さん由来iPS心筋細胞を用いたクライオ電子線トモグラフィーの準備を進める。

Research Products

• [Journal Article] Amyloid deposition through endocytosis in vascular endothelial cells (2024)
  • Author(s): Nishikage Seiji、Fujisawa Akira、Endoh Hiromi、Sakamoto Hirotaka、Suzuki Tomohide、Kanzawa Maki、Ishii Shinichi、Okano Mitsumasa、Nitta Eriko、Yakushijin Kimikazu、Asakura Hidesaku、Nozu Kandai、Nitta Ryo、Katayama Yoshio、Sakaguchi Kazuhiko
  • Journal Title: Experimental Hematology Volume: 129 Pages: 104129-104129
  • DOI: 10.1016/j.exphem.2023.11.003
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] Structural basis of Irgb6 inactivation by Toxoplasma gondii through the phosphorylation of switch I (2024)
  • Author(s): Okuma H, Saijo-Hamano Y, Yamada H, Sherif A.A, Hashizaki E, Sakai N, Kato T, Imasaki T, Kikkawa S, Nitta E, Sasai M, Abe T, Sugihara F, Maniwa Y, Kosako H, Takei K, Daron M. Standley, Yamamoto M, Nitta R
  • Journal Title: Genes Cells. Volume: 29 Issue: 1 Pages: 17-38
  • DOI: 10.1111/gtc.13080
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] TEAD1 trapping by the Q353R?Lamin A/C causes dilated cardiomyopathy (2023)
  • Author(s): Yamada S、et al.,
  • Journal Title: Science Advances Volume: 9 Issue: 15 Pages: 1-1
  • DOI: 10.1126/sciadv.ade7047
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] CD47 promotes peripheral T cell survival by preventing dendritic cell?mediated T cell necroptosis (2023)
  • Author(s): Komori Satomi、Saito Yasuyuki、Nishimura Taichi、Respatika Datu、Endoh Hiromi、Yoshida Hiroki、Sugihara Risa、Iida-Norita Rie、Afroj Tania、Takai Tomoko、Oduori Okechi S.、Nitta Eriko、Kotani Takenori、Murata Yoji、Kaneko Yoriaki、Nitta Ryo、Ohnishi Hiroshi、Matozaki Takashi
  • Journal Title: Proceedings of the National Academy of Sciences Volume: 120 Issue: 33 Pages: 1-1
  • DOI: 10.1073/pnas.2304943120
  • Peer Reviewed / Open Access / Int'l Joint Research
• [Journal Article] CAMSAP2 organizes a γ-tubulin-independent microtubule nucleation centre through phase separation (2022)
  • Author(s): Imasaki T et al.,
  • Journal Title: eLife Volume: 11
  • DOI: 10.7554/elife.77365
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] Structural model of microtubule dynamics inhibition by kinesin-4 from the crystal structure of KLP-12 ?tubulin complex (2022)
  • Author(s): Taguchi S et al.,
  • Journal Title: eLife Volume: 11
  • DOI: 10.7554/elife.77877
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] Recruitment of Irgb6 to the membrane is a direct trigger for membrane deformation (2022)
  • Author(s): Yamada Hiroshi、Abe Tadashi、Nagaoka Hikaru、Takashima Eizo、Nitta Ryo、Yamamoto Masahiro、Takei Kohji
  • Journal Title: Frontiers in Cellular and Infection Microbiology Volume: 12 Pages: 2022-2022
  • DOI: 10.3389/fcimb.2022.992198
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] Structural basis of membrane recognition of <i>Toxoplasma gondii</i> vacuole by Irgb6 (2021)
  • Author(s): Saijo-Hamano Yumiko、Sherif Aalaa Alrahman、Pradipta Ariel、Sasai Miwa、Sakai Naoki、Sakihama Yoshiaki、Yamamoto Masahiro、Standley Daron M、Nitta Ryo
  • Journal Title: Life Science Alliance Volume: 5 Issue: 1 Pages: e202101149-e202101149
  • DOI: 10.26508/lsa.202101149
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Presentation] クロススケール計測で解き明かす微小管ネットワーク形成の分子構造動態 (2024)
  • Author(s): 仁田 亮
  • Organizer: 第二回タンパク質シンポジウム
  • Invited
• [Presentation] 微小管が織りなす生命現象をクロススケール顕微鏡計測で解き明かす (2024)
  • Author(s): 仁田 亮
  • Organizer: 第129回日本解剖学会総会
  • Invited
• [Presentation] Microtubule dynamics regulation by CAMSAPs and Kinesin-4. (2023)
  • Author(s): Ryo Nitta
  • Organizer: THE 49th NAITO CONFERENCE
  • Int'l Joint Research / Invited
• [Presentation] Biological and Medical Applications of Cross-scale Measurements. (2023)
  • Author(s): Ryo Nitta
  • Organizer: 第46回日本分子生物学会年会
  • Int'l Joint Research / Invited
• [Presentation] クライオ電子顕微鏡技術の医生物学応用 (2023)
  • Author(s): 仁田 亮
  • Organizer: 第46回日本分子生物学会年会
  • Invited
• [Presentation] Cross-scale analyses of centrosome-independent microtubule network formation. (2023)
  • Author(s): Ryo Nitta
  • Organizer: The 4th RIKEN BDR-Kobe University Joint Symposium
  • Int'l Joint Research / Invited
• [Presentation] クライオ電子顕微鏡で見る医学・生命科学 (2023)
  • Author(s): 仁田 亮
  • Organizer: 東北大学学際研ライフサイエンスセミナー
  • Invited
• [Presentation] クライオ電子顕微鏡で見る医学・生命科学 (2022)
  • Author(s): 仁田 亮
  • Organizer: 日本顕微鏡学会関西支部講演会
  • Invited
• [Presentation] 細胞骨格ネットワーク構築の分子機構とその破綻 (2022)
  • Author(s): 仁田 亮
  • Organizer: 日本顕微鏡学会第78回学術講演会
  • Invited
• [Presentation] クロススケール計測が解明する細胞骨格ネットワーク構築とその破綻 (2022)
  • Author(s): 仁田 亮
  • Organizer: 第22回日本蛋白質科学会年会
  • Invited
• [Presentation] クライオ電子顕微鏡による細胞骨格イメージング (2022)
  • Author(s): 仁田 亮
  • Organizer: 第8回日本筋学会学術集会
  • Invited
• [Presentation] X線・クライオ電顕で観る構造医科学 微小管ネットワーク形成機構と原虫感染における寄生虫・宿主の攻防 (2022)
  • Author(s): 仁田 亮
  • Organizer: 第70回SPring-8先端利用技術ワークショップ
  • Invited
• [Presentation] Cross-scale analyses of centrosome-independent microtubule network formation (2022)
  • Author(s): Ryo Nitta
  • Organizer: Frontier of Dynamic Structural Biology
  • Int'l Joint Research / Invited
• [Presentation] 凍結電子顕微鏡技術とシングルセル解析技術の融合による構造・機能連関 (2022)
  • Author(s): 仁田 亮
  • Organizer: 第45会日本分子生物学会年会
  • Invited
• [Presentation] クライオ電子顕微鏡で見る医学・生命科学 (2021)
  • Author(s): 仁田 亮
  • Organizer: 横浜市立大学大学院医学研究科 大学院医学セミナー
  • Invited
• [Presentation] Challenges of cryo-EM applications for medical and biological science (2021)
  • Author(s): Ryo Nitta
  • Organizer: RIKEN-BDR Online Retreat
  • Int'l Joint Research / Invited
• [Presentation] クライオ電子顕微鏡で見る医学・生命科学 (2021)
  • Author(s): 仁田 亮
  • Organizer: 京都大学大学院理学研究科 大学院セミナー
  • Invited