クロススケール細胞内分子構造動態解析が解明する選択的オートファジー始動メカニズム

• Project Area: New cross-scale biology
• Project/Area Number: 21H05256
• Research Category: Grant-in-Aid for Transformative Research Areas (A)
• Allocation Type: Single-year Grants
• Review Section: Transformative Research Areas, Section (III)
• Research Institution: Nippon Medical School (2022-2025); The University of Tokyo (2021)
• Principal Investigator: 山本 林 日本医科大学, 大学院医学研究科, 大学院教授 (80551283)
• Project Period (FY): 2021-09-10 – 2026-03-31
• Project Status: Granted (Fiscal Year 2025)
• Budget Amount: ¥70,590,000 (Direct Cost: ¥54,300,000、Indirect Cost: ¥16,290,000); Fiscal Year 2025: ¥12,870,000 (Direct Cost: ¥9,900,000、Indirect Cost: ¥2,970,000); Fiscal Year 2024: ¥12,740,000 (Direct Cost: ¥9,800,000、Indirect Cost: ¥2,940,000); Fiscal Year 2023: ¥12,870,000 (Direct Cost: ¥9,900,000、Indirect Cost: ¥2,970,000); Fiscal Year 2022: ¥12,740,000 (Direct Cost: ¥9,800,000、Indirect Cost: ¥2,940,000); Fiscal Year 2021: ¥19,370,000 (Direct Cost: ¥14,900,000、Indirect Cost: ¥4,470,000)
• Keywords: クロススケール / メゾ複雑体 / オートファジー / 液滴 / LLPS / Fluidophagy / マクロオートファジー / ミクロオートファジー / メゾスケール

Outline of Research at the Start

哺乳類では選択的オートファジーによる細胞内クリアランスが恒常的に行われている。基質が作る液滴を選択的に分解する液滴オートファジー（Fluidophagy）では、液滴と膜の相互作用によってオートファゴソームの膜変形が促されるが、その分子メカニズムは不明である。本研究では、最先端のIn-cell計測技術によって、液滴と膜の相互作用を細胞内のありのままの状態で、ミクロスケールからメゾスケールまでシームレスに定量解析することで、「液滴による膜変形の分子メカニズム」と「膜変形に伴う液滴の標的化メカニズム」の解明を行う。

Outline of Annual Research Achievements

(1) オートファゴソーム膜変形を促す因子のIn-cell、On-membrane解析：鉄貯蔵タンパク質であるフェリチンがNCOA4とともに液滴を形成し、マクロオートファジーとミクロオートファジーの共通基質になることを論文として報告しており、このフェリチン液滴がp62液滴とアダプタータンパク質を共有していることを見出した。フェリチン液滴およびp62液滴の構成因子について誘導性発現HeLa細胞を作成し、これらの液滴同士が隣り合った状態を効率的に作り出す方法を確立しており、個々の液滴の性状に関するin vitroおよびin vivoの解析・計測を領域内共同研究で進めている。
(2) ２つのオートファジーでの「仕分け」と選択的オートファジー始動メカニズムの解析：フェリチン液滴がミクロオートファジー経路に選択的に移行するためのアダプターを複数同定しており、各因子のノックアウトの組み合わせにより、フェリチン液滴ミクロオートファジーとp62液滴ミクロオートファジーの基質認識メカニズムの一部を明らかにした。また、TAX1BP1によるオートファジー関連タンパク質のリクルートメカニズムの解析を行い、ATG9小胞上のSCAMP3がTAX1BP1と相互作用することでATG9小胞をリクルートすることを明らかにした（論文リバイス中）。
(3) 新規蛍光プローブを利用した液滴オートファジー定量法とスクリーニング系の確立：領域内共同研究で開発されたpH応答性蛍光プローブをHaloTag-NCOA4およびHaloTag-p62に導入し、両経路に関わる新規因子のCRISPR スクリーニングを継続して行っている。また、領域内共同研究で新規手法によるマイトファジー誘導実験を行った（論文リバイス中）。
(4) エンドソームミクロオートファジー経路の新規基質の検索：RAB5Q79L誘導性発現による肥大化エンドソームには、フェリチン液滴やp62液滴のほかにも複数の基質が取り込まれることを見出しており、新規分解基質のスクリーニングを進めている。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

フェリチン液滴がマクロオートファジーとミクロオートファジーの共通基質になる分子メカニズムについて論文報告した後も継続して研究を進め、両経路に仕分けされる際のアダプタータンパク質の機能を明らかにするなど、これまで不明であったマクロオートファジーとミクロオートファジーのクロストークについて新たな知見を得ている。さらに、フェリチン液滴だけでなく、他の液滴基質まで解析を拡大する予定で、研究全体としておおむね順調に進展している。また、昨年度に論文報告したHaloTag型の新規オートファジー活性定量プローブを利用したスクリーニング系を新たに確立しており、研究は順調に進んでいる。一方、in-cellでの液滴の性状解析については、必要なノックイン細胞を作成するなど計画に合わせて進めているが、計測そのものは難易度が高く、今後のさらなる改善が必要である。また、TAX1BP1相互作用因子の同定など新たな展開もあり、研究全体としておおむね順調に進展している。

Strategy for Future Research Activity

昨年度までに作成した形状ラベル（HaloTag）ノックイン細胞を用いて、本領域の目標である液滴オートファジーのin-cell解析を進める。また、液滴ミクロオートファジー特異的因子（マクロオートファジーとミクロオートファジーの仕分けを制御する因子）を同定しており、その機能解析を継続するが、この解析はフェリチン液滴だけでなく他の液滴まで拡大することを計画しており、これまで分子レベルでの切り分けができていなかったマクロオートファジーとミクロオートファジーの仕分けおよびクロストークについて分子メカニズムを明らかにするとともにその一般化を目指す。また、新規の液滴基質のスクリーニングを進めており、このスクリーニングで同定された液滴因子についても同様の解析に供する予定である。これらの解析を通してミクロオートファジーの生理的意義の解明まで研究を拡大し、さらに液滴の細胞外分泌へと解析を進める。

Research Products

• [Journal Article] Molecular Mechanisms of Macroautophagy, Microautophagy, and Chaperone-Mediated Autophagy (2024)
  • Author(s): Yamamoto Hayashi、Matsui Takahide
  • Journal Title: Journal of Nippon Medical School Volume: 91 Issue: 1 Pages: 2-9
  • DOI: 10.1272/jnms.JNMS.2024_91-102
  • ISSN: 1345-4676, 1347-3409
  • Year and Date: 2024-02-25
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Syntaxin 17 recruitment to mature autophagosomes is temporally regulated by PI4P accumulation (2024)
  • Author(s): Shinoda Saori、Sakai Yuji、Matsui Takahide、Uematsu Masaaki、Koyama-Honda Ikuko、Sakamaki Jun-ichi、Yamamoto Hayashi、Mizushima Noboru
  • Journal Title: eLife Volume: in press
  • DOI: 10.7554/elife.92189
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] Autophagy genes in biology and disease (2023)
  • Author(s): Yamamoto Hayashi、Zhang Sidi、Mizushima Noboru
  • Journal Title: Nature Reviews Genetics Volume: - Issue: 6 Pages: 382-400
  • DOI: 10.1038/s41576-022-00562-w
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] NCOA4 drives ferritin phase separation to facilitate macroferritinophagy and microferritinophagy (2022)
  • Author(s): Ohshima Tomoko、Yamamoto Hayashi、Sakamaki Yuriko、Saito Chieko、Mizushima Noboru
  • Journal Title: Journal of Cell Biology Volume: 221 Issue: 10
  • DOI: 10.1083/jcb.202203102
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] A pulse-chasable reporter processing assay for mammalian autophagic flux with HaloTag (2022)
  • Author(s): Yim Willa Wen-You、Yamamoto Hayashi、Mizushima Noboru
  • Journal Title: eLife Volume: 11
  • DOI: 10.7554/elife.78923
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] A HaloTag-based reporter processing assay to monitor autophagic flux (2022)
  • Author(s): Wen-You Yim Willa、Yamamoto Hayashi、Mizushima Noboru
  • Journal Title: Autophagy Volume: 19 Issue: 4 Pages: 1363-1364
  • DOI: 10.1080/15548627.2022.2123638
  • Peer Reviewed
• [Presentation] Ferritin phase separation driven by NCOA4, which facilitates ferritin degradation by macroautophagy and endosomal microautophagy (2023)
  • Author(s): Hayashi Yamamoto
  • Organizer: 第46回日本分子生物学会年会
  • Invited
• [Presentation] Ferritin phase separation driven by NCOA4, which facilitates ferritin degradation by macroautophagy and endosomal microautophagy (2023)
  • Author(s): Hayashi Yamamoto
  • Organizer: YU-COE(C) Intracellular Iron Symposium Joint with 46th MBSJ Symposium
  • Invited
• [Presentation] フェリチンは液滴を形成することでマクロオートファジーとミクロオートファジーの２つの経路でリソソームに輸送される (2022)
  • Author(s): 山本林、大島知子、酒巻有里子、齊藤知恵子、水島昇
  • Organizer: 第95回日本生化学会大会
• [Presentation] A novel method for measuring autophagic flux in mammalian cells: pulse-chasable HaloTag processing assay (2022)
  • Author(s): Hayashi Yamamoto、Willa Wen-You Yim、Noboru Mizushima
  • Organizer: The 10th International Symposium on Autophagy
  • Int'l Joint Research
• [Presentation] Ferritin phase separation driven by NCOA4 promotes two types of ferritin autophagy, macro-autophagy and endosomal micro-autophagy (2022)
  • Author(s): 山本林
  • Organizer: 第60回日本生物物理学会年会
  • Invited
• [Presentation] Phase separation in ferritinophagy (2022)
  • Author(s): Hayashi Yamamoto
  • Organizer: A3 Autophagy Conference 2022
  • Invited
• [Presentation] フェリチンは液滴を形成することにより２つの経路でリソソームに輸送される (2021)
  • Author(s): 大島 知子、山本 林、酒巻 有里子、齊藤 知恵子、水島 昇
  • Organizer: 第44回 日本分子生物学会年会
• [Book] 「生化学」鉄貯蔵タンパク質フェリチンの液滴形成と二つのオートファジー経路での分解 (2023)
  • Author(s): 山本林、水島昇
  • Total Pages: 5
  • Publisher: 日本生化学会
• [Book] 「顕微鏡」新たな顕微技術が明らかにする細胞内分子動態 (2023)
  • Author(s): 井澤俊明、稲葉謙次、齊藤知恵子、山本林、関根清薫、倉永英里奈、野村高志、田中元雅
  • Total Pages: 5
  • Publisher: 日本顕微鏡学会
• [Book] 「細胞」簡便で汎用性の高いオートファジー定量法 (2023)
  • Author(s): 山本林
  • Total Pages: 4
  • Publisher: ニューサイエンス社
• [Book] 月刊「細胞」2023年 4月号 (2023)
  • Author(s): 山本 林
  • Total Pages: 4
  • Publisher: ニューサイエンス社