クロススケール細胞内分子構造動態解析が解明する選択的オートファジー始動メカニズム
| Project Area | New cross-scale biology |
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| Project/Area Number |
21H05256
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| Research Category |
Grant-in-Aid for Transformative Research Areas (A)
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| Allocation Type | Single-year Grants |
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| Review Section |
Transformative Research Areas, Section (III)
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| Research Institution | Nippon Medical School (2022-2024)
The University of Tokyo (2021) |
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Principal Investigator |
山本 林 日本医科大学, 大学院医学研究科, 大学院教授 (80551283)
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| Project Period (FY) |
2021-09-10 – 2026-03-31
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| Project Status |
Granted (Fiscal Year 2024)
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| Budget Amount *help |
¥70,590,000 (Direct Cost: ¥54,300,000、Indirect Cost: ¥16,290,000)
Fiscal Year 2024: ¥12,740,000 (Direct Cost: ¥9,800,000、Indirect Cost: ¥2,940,000)
Fiscal Year 2023: ¥12,870,000 (Direct Cost: ¥9,900,000、Indirect Cost: ¥2,970,000)
Fiscal Year 2022: ¥12,740,000 (Direct Cost: ¥9,800,000、Indirect Cost: ¥2,940,000)
Fiscal Year 2021: ¥19,370,000 (Direct Cost: ¥14,900,000、Indirect Cost: ¥4,470,000)
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| Keywords | クロススケール / メゾ複雑体 / オートファジー / LLPS / Fluidophagy / 液滴 / マクロオートファジー / ミクロオートファジー / メゾスケール |
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| Outline of Research at the Start |
哺乳類では選択的オートファジーによる細胞内クリアランスが恒常的に行われている。基質が作る液滴を選択的に分解する液滴オートファジー（Fluidophagy）では、液滴と膜の相互作用によってオートファゴソームの膜変形が促されるが、その分子メカニズムは不明である。本研究では、最先端のIn-cell計測技術によって、液滴と膜の相互作用を細胞内のありのままの状態で、ミクロスケールからメゾスケールまでシームレスに定量解析することで、「液滴による膜変形の分子メカニズム」と「膜変形に伴う液滴の標的化メカニズム」の解明を行う。
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| Outline of Annual Research Achievements |
(1) オートファゴソーム膜変形を促す因子のIn-cell、On-membrane解析：鉄貯蔵タンパク質であるフェリチンがNCOA4とともに液滴を形成し、マクロオートファジーとミクロオートファジーの共通基質になることを論文として報告した（Ohshima et al., JCB, 2022）。フェリチン液滴が膜と相互作用する際の詳細局在をin-cellで解析するため、形状ラベルをCRISPR法でノックインし、(3)のオートファジー定量法と組み合わせて機能解析を行った。フェリチン液滴と隣り合って局在するp62液滴についても同様のノックインを行い、in-cell解析の準備を進めている。
(2) ２つのオートファジーでの「仕分け」と選択的オートファジー始動メカニズムの解析：フェリチン液滴がマクロオートファジーとミクロオートファジーの両経路に仕分けされる分子メカニズムの解析を行い、RAB5Q79L誘導性発現細胞を用いることでミクロオートファジー特異的因子を同定した。この因子のノックアウトではフェリチン液滴ミクロオートファジーは阻害されるものの、p62液滴ミクロオートファジーには影響がなく、液滴オートファジーの機能分化を解明するための示唆的結果を得た。また、TAX1BP1によるオートファジー関連タンパク質のリクルートメカニズムの解析を行い、ATG9小胞上のSCAMP3がTAX1BP1と相互作用することでATG9小胞をリクルートすることを明らかにした（論文準備中）。
(3) 新規蛍光プローブを利用した液滴オートファジー定量法とスクリーニング系の確立：領域内共同研究で開発されたpH応答性蛍光プローブをHaloTag-NCOA4に導入し、昨年度までに行った液滴オートファジーの新規スクリーニング系を使って一次スクリーニングを行った。HaloTagを利用した新規オートファジー活性定量法を確立した（Yim et al., eLife, 2022）。他に領域内共同研究で、新規手法によるマイトファジー誘導実験を行った（論文改訂中）。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
1: Research has progressed more than it was originally planned.
Reason
フェリチン液滴オートファジーについて解析を進め、フェリチン液滴がマクロオートファジーとミクロオートファジーの共通基質になる分子メカニズムを解明して論文報告するなど、液滴オートファジーの解析で想定以上の成果を挙げている。また、HaloTagを利用した新規オートファジー活性定量法を確立して論文報告を行った。オートファジー国際会議でもすでに複数の研究者が本定量法を使用するなど、国内外のオートファジー研究者から高く評価されている。in-cell解析に向けて必要なノックイン細胞を作成し、計画に合わせて研究を進められている。また、TAX1BP1相互作用因子の同定など新たな展開もあり、研究全体として当初の計画以上に進展している。
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| Strategy for Future Research Activity |
今年度までに作成した形状ラベル導入細胞を用いて、本領域の目標である液滴オートファジーのin-cell解析を進める。特にin-cell AFMでの液滴物性の計測に注力し、in-cellとin vitroでの物性の違いなどを明らかにする。また、液滴ミクロオートファジー特異的因子の同定に成功しており、その機能解析を進めるとともに、これまで分子レベルでの切り分けができていなかったマクロオートファジーとミクロオートファジーについて、それぞれを特異的に引き起こす変異細胞の樹立を行う。この細胞を用いてミクロオートファジーの生理的意義の解明を行い、さらに液滴分泌へと解析を進める。
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Report
(2 results)
Research Products
(10 results)
