非線形ラマン散乱を用いた細胞内超硫黄分子のin situ検出と動的変化の解明

• Project Area: Life Science Innovation Driven by Supersulfide Biology
• Project/Area Number: 21H05261
• Research Category: Grant-in-Aid for Transformative Research Areas (A)
• Allocation Type: Single-year Grants
• Review Section: Transformative Research Areas, Section (III)
• Research Institution: Tohoku University
• Principal Investigator: 中林 孝和 東北大学, 薬学研究科, 教授 (30311195)
• Project Period (FY): 2021-09-10 – 2026-03-31
• Project Status: Granted (Fiscal Year 2024)
• Budget Amount: ¥72,930,000 (Direct Cost: ¥56,100,000、Indirect Cost: ¥16,830,000); Fiscal Year 2024: ¥11,830,000 (Direct Cost: ¥9,100,000、Indirect Cost: ¥2,730,000); Fiscal Year 2023: ¥11,960,000 (Direct Cost: ¥9,200,000、Indirect Cost: ¥2,760,000); Fiscal Year 2022: ¥13,650,000 (Direct Cost: ¥10,500,000、Indirect Cost: ¥3,150,000); Fiscal Year 2021: ¥24,310,000 (Direct Cost: ¥18,700,000、Indirect Cost: ¥5,610,000)
• Keywords: 超硫黄分子 / ラマン顕微鏡 / 非線形ラマン散乱 / タンパク質 / 密度汎関数法 / 膜透過性高分子 / 量子化学計算 / 単一生細胞 / 濃度定量 / 非線形ラマン / SOD1 / 酸化作用 / 機械学習 / 密度汎関数 / 蛍光寿命

Outline of Research at the Start

超硫黄分子の生体内での役割を理解するためには、生細胞内にある超硫黄分子のその場観測と動的変化を理解することが必要である。本研究では、ピコ秒パルスレーザーを用いる非線形ラマン散乱と蛍光を組み合わせた新たな顕微システムを構築し、細胞内での超硫黄分子の細胞内分布、濃度、代謝のダイナミクス計測を目指す。さらに、分子動力学計算や機械学習などの様々な解析手法を用いて、超硫黄分子の生理機能の分子論的解明、超硫黄分子の発現と細胞内環境との相関についても検討する。

Outline of Annual Research Achievements

単一生細胞内に超硫黄分子を導入し、細胞内での超硫黄分子の画像化、代謝過程をラマンイメージングを用いて観測することに成功した。試料としてジメチルトリスルフィドとコントロールとしてジメチルジスルフィドを用い、膜透過性高分子であるリン脂質高分子MPCを用いて水溶化させ、培養下にあるHeLa細胞内の高効率導入を行った。S-S伸縮振動バンドが細胞内で明瞭に観測され、S-Sバンドによるイメージング測定を行った。トリスルフィド体は、脂肪滴とミトコンドリアに選択的に局在することを示した。一方、ジスルフィド体はトリスルフィド体ほど細胞内に導入されず、脂肪滴にある程度局在するものの、ミトコンドリアへの局在は観測されなかった。また、トリスルフィド体に導入された脂肪滴はトリスルフィド以外のS-Sバンドが観測され、テトラスルフィドやペンタスルフィドなど硫黄鎖の伸長反応が生細胞内の脂肪滴で生じることを示した。オレイン酸のような脂質中では伸長反応が生じないことから、脂肪滴内の酵素によって伸長反応が生じたと考えられる。私達が提案することができた水のラマンバンドを用いた濃度定量法を単一生細胞内にある超硫黄分子に適用し、超硫黄分子の濃度定量・濃度イメージングも行うことができた。前年度に製作した非線形ラマン散乱であるCARS顕微鏡に改良を加え感度向上を行い、次年度ではPMCを用いた超硫黄分子の細胞内導入過程をリアルタイムで観測することを予定している。また2次元相関、機械学習などの振動スペクトルの解析法の開発・整備も引き続き行った。超硫黄分子の細胞内導入に伴う細胞状態変化の検出をこれらの解析法を用いて行う予定である。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

超硫黄分子の細胞内ラマンイメージングの測定は硫黄単体であるS8以外では初めてであると思われる。細胞内分布や代謝なども信号雑音比が高く観測することができた。CARS顕微鏡と組み合わせることで超硫黄の動態を明らかにできると考えている。振動スペクトルの解析手法の蓄積も行い、おおむね順調に進展しているとした。

Strategy for Future Research Activity

超硫黄分子の細胞内導入と代謝過程のラマンイメージング測定のプロコトルを確立できたため、他の超硫黄分子への展開、製作したCARS顕微鏡への応用を行う。硫黄鎖依存性、量子化学計算を用いた代謝化合物の同定も行う。今年度できなかった蛍光寿命との組み合わせも行う予定である。2次元相関、機械学習、多変量スペクトル解析などのラマンスペクトルの解析法を用いて、超硫黄分子の細胞内導入に伴う細胞状態変化、細胞内分子の濃度変化の定量なども行う。

Research Products

• [Int'l Joint Research] 台湾陽明交通大学(その他の国・地域 台湾)
• [Int'l Joint Research] 台湾国立陽明交通大学(その他の国・地域 台湾)
• [Journal Article] Establishment of a Method for the Introduction of Poorly Water-Soluble Drugs in Cells and Evaluation of Intracellular Concentration Distribution Using Resonance Raman Imaging (2024)
  • Author(s): Koga Keisuke、Kajimoto Shinji、Yoshizaki Yuta、Takahashi Hiroaki、Kageyama Lisa、Konno Tomohiro、Nakabayashi Takakazu
  • Journal Title: The Journal of Physical Chemistry B Volume: 128 Issue: 6 Pages: 1350-1359
  • DOI: 10.1021/acs.jpcb.3c06601
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Visualization of the sequence of changes in the full wavenumber range by two-dimensional correlation spectroscopy (2023)
  • Author(s): Ban Kazunori、Miyata Daisuke、Matsumoto Yoshiteru、Tahara Shinya、Takahashi Hiroaki、Morita Shin-ichi、Nakabayashi Takakazu
  • Journal Title: Chemical Physics Letters Volume: 833 Pages: 140930-140930
  • DOI: 10.1016/j.cplett.2023.140930
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] ラマンイメージングを用いた細胞内の水・夾雑環境の理解 (2022)
  • Author(s): 中林孝和, 梶本真司
  • Journal Title: Seibutsu-kogaku Kaishi Volume: 100 Issue: 7 Pages: 367-370
  • DOI: 10.34565/seibutsukogaku.100.7_367
  • ISSN: 0919-3758, 2435-8630
  • Year and Date: 2022-07-25
• [Journal Article] Label-free quantification of a protein liquid droplet using Raman microscopy (2022)
  • Author(s): 中林孝和, 黒井邦巧, 梶本真司
  • Journal Title: 生化学 Volume: 94 Issue: 3 Pages: 444-448
  • DOI: 10.14952/SEIKAGAKU.2022.940444
  • ISSN: 0037-1017
  • Year and Date: 2022-06-25
• [Journal Article] SOD1 gains pro-oxidant activity upon aberrant oligomerization: change in enzymatic activity by intramolecular disulfide bond cleavage (2022)
  • Author(s): Yamazaki Kosuke、Tahara Shinya、Ohyama Takumi、Kuroi Kunisato、Nakabayashi Takakazu
  • Journal Title: Scientific Reports Volume: 12 Issue: 1 Pages: 11750-11750
  • DOI: 10.1038/s41598-022-15701-w
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Presentation] ラマン顕微鏡の応用：光を使って単一細胞内の薬剤・生体分子の濃度をその場定量する (2024)
  • Author(s): 中林孝和
  • Organizer: 日本薬学会第144年会シンポジウム光を用いた次世代Photo Bio Medici
  • Invited
• [Presentation] 分子分光学的手法を駆使した生体分子および細胞内現象のその場解析 (2024)
  • Author(s): 中林孝和
  • Organizer: 日本化学会第104春季年会学術賞受賞講演
  • Invited
• [Presentation] ラマン顕微鏡を用いた細胞内超硫黄分子のラベルフリー動態評価 (2024)
  • Author(s): 古賀圭祐
  • Organizer: 日本薬学会第144年会
• [Presentation] 細胞内の液滴の中に何があるのか、どのくらいあるのか、どうしてあるのかをラマンイメージングで探る (2023)
  • Author(s): 中林孝和
  • Organizer: 生体分子凝縮体勉強会
  • Invited
• [Presentation] Quantification of Intracellular Molecules in a Living Cell Using Raman Imaging" (2023)
  • Author(s): Takakazu Nakabayashi
  • Organizer: 16h International Symposium on Nanomedicine
  • Int'l Joint Research / Invited
• [Presentation] 細胞内分子の濃度を直接測る～細胞内混雑環境とタンパク質液滴との関係～ (2023)
  • Author(s): 中林孝和
  • Organizer: 第13回CSJ化学フェスタ2023
  • Invited
• [Presentation] Measurements of Water in a Living Cell: Application to Evaluate Intracellular Environments (2023)
  • Author(s): Takakazu Nakabayashi
  • Organizer: GP-Chem Kickoff Symposium
  • Int'l Joint Research / Invited
• [Presentation] Application of Water Raman Bands to Evaluate Intracellular Environments and Liquid-Liquid Phase Separation (2023)
  • Author(s): Takakazu Nakabayashi
  • Organizer: The Eighth Taiwan International Symposium on Raman Spectroscopy
  • Int'l Joint Research / Invited
• [Presentation] 水のラマンバンドを用いた細胞・タンパク質のその場定量解析 (2023)
  • Author(s): 中林孝和
  • Organizer: 第45回日本光医学・光生物学会
  • Invited
• [Presentation] ラマンイメージングによる難水溶性薬剤の細胞内分布定量解析 (2023)
  • Author(s): 古賀圭祐
  • Organizer: 第17回分子科学討論会
• [Presentation] ラマンイメージングを用いた細胞内の水計測とその場定量への応用 (2023)
  • Author(s): 中林孝和
  • Organizer: 電子情報通信学会2023年総合大会シンポジウム
  • Invited
• [Presentation] Intramolecular disulfide bond switches enzymatic activity of SOD1 (2022)
  • Author(s): Shinya Tahara, Kosuke Yamazaki, Takumi Ohyama, Kunisato Kuroi, Takakazu Nakabayashi
  • Organizer: 第60回日本生物物理学会年会
  • Invited
• [Presentation] Water in a living cell probed by a Raman microscopy (2022)
  • Author(s): Takakazu Nakabayashi
  • Organizer: EMLG/JMLG 2022 Annual Meeting
  • Int'l Joint Research / Invited
• [Presentation] 細胞・タンパク質のラベルフリーイメージングでわかったこと・これからの課題 (2022)
  • Author(s): 中林孝和
  • Organizer: 第31回日本バイオイメージング学会
  • Invited
• [Presentation] Dynamics and structural changes associated with liquid-liquid phase separation in neurodegenerative disease-related proteins (2022)
  • Author(s): Takakazu Nakabayashi
  • Organizer: The 7th Japan-Taiwan Joint Symposium for Pharmaceutical Sciences
  • Int'l Joint Research / Invited
• [Presentation] 液-液相分離を用いたタンパク質濃縮法の開発と高感度ラマン計測への展開 (2022)
  • Author(s): 飛田怜央奈、田原進也、梶本真司、中林孝和
  • Organizer: 2022 年度生物物理学会北海道支部・東北支部合同例会
• [Presentation] Raman analyses of supersulfides and S8 in vitro and in human living cells (2022)
  • Author(s): Lisa Kageyama, Shinji Kajimoto, Shinya Tahara, Takakazu Nakabayashi
  • Organizer: 第60回日本生物物理学会年会
• [Presentation] ラマン顕微鏡を用いた硫黄・細胞内状態計測 (2022)
  • Author(s): 中林孝和
  • Organizer: 第2回レドックスR&D戦略委員会春のシンポジウム
  • Invited
• [Presentation] 顕微ラマン分光によるラベルフリー細胞生物研究 (2022)
  • Author(s): 中林孝和
  • Organizer: 第35回日本放射光学会年会・放射光科学合同シンポジウム
  • Invited