Genetic analysis of nuage formation regulated by non-domain type proteins

• Project Area: Biology of Non-domain Biopolymer
• Project/Area Number: 21H05275
• Research Category: Grant-in-Aid for Transformative Research Areas (A)
• Allocation Type: Single-year Grants
• Review Section: Transformative Research Areas, Section (III)
• Research Institution: The University of Osaka
• Principal Investigator: 甲斐 歳恵 大阪大学, 大学院生命機能研究科, 教授 (40579786)
• Project Period (FY): 2021-09-10 – 2026-03-31
• Project Status: Granted (Fiscal Year 2025)
• Budget Amount: ¥96,070,000 (Direct Cost: ¥73,900,000、Indirect Cost: ¥22,170,000); Fiscal Year 2025: ¥18,070,000 (Direct Cost: ¥13,900,000、Indirect Cost: ¥4,170,000); Fiscal Year 2024: ¥17,810,000 (Direct Cost: ¥13,700,000、Indirect Cost: ¥4,110,000); Fiscal Year 2023: ¥17,940,000 (Direct Cost: ¥13,800,000、Indirect Cost: ¥4,140,000); Fiscal Year 2022: ¥17,940,000 (Direct Cost: ¥13,800,000、Indirect Cost: ¥4,140,000); Fiscal Year 2021: ¥24,310,000 (Direct Cost: ¥18,700,000、Indirect Cost: ¥5,610,000)
• Keywords: 非ドメイン型タンパク質 / 非膜オルガネラ / ヌアージュ / piRNA

Outline of Research at the Start

非膜オルガネラは、天然変性領域を持つタンパク質や、強固な二次構造をとらないRNA分子（総称して非ドメイン型バイオポリマーと呼ぶ）が集合して形成される分子凝集体である。非膜オルガネラの形成には、非ドメイン型バイオポリマーが仲介する多価の弱い相互作用の関与が報告されているが、その具体的な生理機能や生体内における制御機構に関しては不明なものが多い。本計画研究では、ショウジョウバエをモデル系として、組織および個体レベルでのドメイン型バイオポリマーの生理機能を解明する。また、生理機能の対応づけが確立しているヌアージュをモデルシステムとして、非膜オルガネラ構成因子の動作機構を個体レベルで検証する。

Outline of Annual Research Achievements

非膜オルガネラ・ヌアージュの構造因子であるTdrd5(Tej)は、他のヌアージュタンパク質、Vasa、Tdrd9 (Spn-E)とそれぞれ LOTUSとSRSという別個のモチーフを通じて相互作用し、それらをヌアージュへリクルートし、piRNA前駆体をヌアージュへリクルートするために機能していることが明らかとなった(2023 PMID: 37555815)。これらの蛋白を含む20種のヌアージュ構成因子間の400ペアの結合を、AlphaFold2を用いてin silicoでスクリーニングし、未報告のタンパク質間結合ペアを複数見出した。その一部については細胞内実験により実際の結合を確認し、さらに結合残基の予測と変異体解析を通じて、AlphaFold2による構造予測の有用性を示した。この成果は2024年３月末時点で国際ピアジャーナルeLifeでリバイズ中である。Tdrd9 (Spn-E)と相互作用が示されたSquashタンパク質について、さらに機能解析を行なっており、今年度中に論文として発表予定である。また、領域内の稲田らとの共同研究として、eRF1のメチル化による翻訳終結制御機構を国際ピアジャーナルのDevelopmentに発表した（2024 PMID: 38881530）。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

同領域内の尾山らとは、PIWIファミリータンパク質及びTdrd5、Vasa、Tdrd9 (Spn-E)の近位性タンパク質ラベル法による新たなヌアージュ構成因子の探索を行い、有望な候補タンパク質について機能解析を進めている。そのうち、Hrb27CおよびSet1については、生殖細胞のノックダウンによってヌアージュの形成もしくはトランスポゾンの抑制に異常が観察された。詳細な分子機構について、現在、論文を執筆中で、今年度中の発表を目指している。RINGモチーフを持つTdrd4(Kumo)については、生体内および試験管内でのユビキチン化活性を確認済みであり、このユビキチン化活性中心を変異させたKumoタンパク質はヌアージュへの局在が失われたことから、ユビキチン化活性がヌアージュへの集積に重要であることが示唆されている。現在、基質を同定中である。

Strategy for Future Research Activity

現在、ヌアージュの形成機構については、タンパク質因子とRNA因子の両方を解析している。前者については、進捗状況で述べたとおり、既知タンパク質の近位性ラベリング法によって同定された因子の遺伝学的解析が進行中である。RNA因子については、領域内の木村らとの共同研究としてPICによる解析を進めつつある。具体的には、野生型ヌアージュに集積しているRNA及びTDRD5欠損の形成不全ヌアージュに集積しているRNAをPICでシーケンス解析し、ヌアージュ形成不全によるpiRNAプロセシングへの影響を精査する予定である。また、前述のin silico解析でRNAヘリカーゼであるTdrd9(Spn-E)と相互作用することが示唆されたBoYbやSquについても、piRNA生合成経路における分子機能を解析しており、それぞれ他のヌアージュ因子との結合や、結合に必要なドメインの同定、piRNAピンポン経路やフェージング経路における機能についてのデータを得るため、piRNAシークエンス解析等を進めている。さらに、Tdrd4(Kumo)のユビキチン化活性の生理機能についても解析を進め、基質同定を通じて、非膜構造体ヌアージュにおける役割を明らかにする予定である。また、現在、PIWIファミリータンパク質の翻訳後修飾を見出しており、それらの生理学的意義の解析を進めている。今後は、ヌアージュタンパク質の翻訳後修飾による、それらのヌアージュへのアセンブリーとpiRNA生合成への影響を解析予定である。さらにカイコの生殖系列細胞を用いた解析でも確認しており、今後はマウス精巣を用いて種横断的な保守性を検討し、機能解析を進める。これらの成果をもとに複数の論文投稿を予定している。

Research Products

• [Journal Article] HemK2 functions for sufficient protein synthesis and RNA stability through eRF1 methylation during Drosophila oogenesis (2024)
  • Author(s): Fengmei Xu, Ritsuko Suyama, Toshifumi Inada, Shinichi Kawaguchi, Toshie Kai
  • Journal Title: Development Volume: 151 Issue: 14
  • DOI: 10.1242/dev.202795
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] piRNA processing within non-membrane structures is governed by constituent proteins and their functional motifs (2024)
  • Author(s): Ritsuko Suyama, Toshie Kai
  • Journal Title: The FEBS Journal Volume: - Issue: 11 Pages: 2715-2736
  • DOI: 10.1111/febs.17360
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] Nondomain biopolymers: Flexible molecular strategies to acquire biological functions (2023)
  • Author(s): Arakawa K, Hirose T, Inada T, Ito T, Kai T, Oyama M, Tomari Y, Yoda T, Nakagawa S.
  • Journal Title: Genes to Cells Volume: 28 Issue: 8 Pages: 539-552
  • DOI: 10.1111/gtc.13050
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] miRNA/siRNA-directed pathway to produce noncoding piRNAs from endogenous protein-coding regions ensures <i>Drosophila</i> spermatogenesis (2023)
  • Author(s): Iki Taichiro、Kawaguchi Shinichi、Kai Toshie
  • Journal Title: Science Advances Volume: 9 Issue: 29 Pages: 1-15
  • DOI: 10.1126/sciadv.adh0397
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] Tejas functions as a core component in nuage assembly and precursor processing in Drosophila piRNA biogenesis (2023)
  • Author(s): Yuxuan Lin, Ritsuko Suyama, Shinichi Kawaguchi, Taichiro Iki, Toshie Kai
  • Journal Title: Journal of Cell Biology Volume: 222(10) Issue: 10
  • DOI: 10.1083/jcb.202303125
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] The Tudor Domain-Containing Protein, Kotsubu (CG9925), Localizes to the Nuage and Functions in piRNA Biogenesis in D. melanogasterr (2022)
  • Author(s): Lin-Xenia Lim, Wakana Isshiki, Taichiro Iki, Shinichi Kawaguchi, Toshie Kai
  • Journal Title: Frontiers in Molecular Biosciences Volume: 9 Pages: 818302-818302
  • DOI: 10.3389/fmolb.2022.818302
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Presentation] BioID法を用いたPIWIタンパク質近接因子の探索とpiRNA経路に関わる新規因子の同定 (2024)
  • Author(s): 一色和奏
  • Organizer: 第47回日本分子生物学会年会
  • Int'l Joint Research
• [Presentation] Analysis of the Molecular Function of Squash, a Crucial piRNA Component for Germline Genome Integrity (2024)
  • Author(s): XU XIN
  • Organizer: 第47回日本分子生物学会年会
  • Int'l Joint Research
• [Presentation] 生殖細胞特異的な非膜オルガネラ・ヌアージュの構築原理と機能 (2023)
  • Author(s): 甲斐歳恵
  • Organizer: 学術変革領域「非ドメイン生物学」領域班会議
• [Presentation] piRNA前駆体プロセシング機構の解明 (2023)
  • Author(s): 須山律子
  • Organizer: 学術変革領域「非ドメイン生物学」領域班会議
• [Presentation] piRNA経路新規因子の探索 (2023)
  • Author(s): 一色和奏
  • Organizer: 学術変革領域「非ドメイン生物学」領域班会議
• [Presentation] 生殖細胞特異的な皮膜オルガネラ・ヌアージュの構造と機能 (2023)
  • Author(s): 甲斐歳恵
  • Organizer: 第33回フォーラム・イン・ドージン
  • Invited
• [Presentation] 微生物叢が担う生殖機能の発現ダイナミクスとその分子機能 (2023)
  • Author(s): 須山律子
  • Organizer: 先進ゲノム支援2023年領域班会議
• [Presentation] Discovering novel factors in piRNA pathway by proximity proteome screening in Drosophila melanogaster (2023)
  • Author(s): 一色和奏
  • Organizer: 第1回細胞生物コロキウム
• [Presentation] BioID法によるpiRNA経路新規因子の探索と同定 (2023)
  • Author(s): 一色和奏
  • Organizer: 第46回日本分子生物学会年会
  • Int'l Joint Research
• [Presentation] Tejas Functions in piRNA Biogenesis via Nuage Assembly in Drosophila (2022)
  • Author(s): 甲斐歳恵
  • Organizer: 2022 EMBO Workshop on PIWI Proteins and piRNAs
• [Presentation] eRF1 methylation ensures proper oogenesis in Drosophila melanogaster (2022)
  • Author(s): 甲斐歳恵
  • Organizer: 学術変革領域「非ドメイン生物学」領域班会議
• [Presentation] Identification of PIWI-interactors by BioID in Drosophila ovary (2022)
  • Author(s): 甲斐歳恵
  • Organizer: 学術変革領域「非ドメイン生物学」領域班会議
• [Presentation] Tejas functions as a core component of nuage assembly and precursor processing in Drosophila piRNA biogenesis (2022)
  • Author(s): 須山律子
  • Organizer: 学術変革領域「非ドメイン生物学」領域班会議
• [Presentation] BiolD-based biochemical screening and functional analysis of novel factors involved in piNA-mediated transposon regulation in Drosophila melanogaster (2022)
  • Author(s): 一色和奏
  • Organizer: 第45回分子生物学会年会
• [Presentation] HemK2 is a methyltransferase ensuring efficient protein production and mRNA stability during oogenesis in Drosophila melanogaster (2022)
  • Author(s): Fengmei Xu
  • Organizer: 第45回分子生物学会年会
• [Presentation] Function of RING domain in Kumo, a Tudor-domain containing protein involved in piRNA biogenesis and transposon regulation (2022)
  • Author(s): Lim Lin Xenia
  • Organizer: 第45回分子生物学会年会
• [Presentation] ショウジョウバエにおけるTejasとSpn-EによるpiRNA生合成のためのヌアージュ構築の分子基盤 (2021)
  • Author(s): Lin Yuxuan, Kawaguchi Shinichi, Iki Taichiro, Suyama Ritsuko, Kai Toshie
  • Organizer: 第44回分子生物学会年会
• [Remarks] 生殖ゲノムを守る「雲（ヌアージュ）」を形成する機構を解明
  • URL: https://www.fbs.osaka-u.ac.jp/ja/research_results/papers/detail/1069
• [Remarks] タンパク質をコードする情報を「非コード化」させる生命現象の発見
  • URL: https://www.fbs.osaka-u.ac.jp/ja/research_results/papers/detail/1066
• [Funded Workshop] 第46回日本分子生物学会年会 (2023)
• [Funded Workshop] RIKEN Symposium 2023・The 2nd KANSAI RNA Club (2023)