Structural Analysis of Non Domain Biopolymer

• Project Area: Biology of Non-domain Biopolymer
• Project/Area Number: 21H05281
• Research Category: Grant-in-Aid for Transformative Research Areas (A)
• Allocation Type: Single-year Grants
• Review Section: Transformative Research Areas, Section (III)
• Research Institution: Institute of Physical and Chemical Research
• Principal Investigator: 伊藤 拓宏 国立研究開発法人理化学研究所, 生命機能科学研究センター, チームリーダー (70401164)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 西増 弘志 東京大学, 先端科学技術研究センター, 教授 (00467044)
• Project Period (FY): 2021-09-10 – 2026-03-31
• Project Status: Granted (Fiscal Year 2024)
• Budget Amount: ¥107,380,000 (Direct Cost: ¥82,600,000、Indirect Cost: ¥24,780,000); Fiscal Year 2025: ¥20,670,000 (Direct Cost: ¥15,900,000、Indirect Cost: ¥4,770,000); Fiscal Year 2024: ¥20,410,000 (Direct Cost: ¥15,700,000、Indirect Cost: ¥4,710,000); Fiscal Year 2023: ¥20,540,000 (Direct Cost: ¥15,800,000、Indirect Cost: ¥4,740,000); Fiscal Year 2022: ¥20,540,000 (Direct Cost: ¥15,800,000、Indirect Cost: ¥4,740,000); Fiscal Year 2021: ¥25,220,000 (Direct Cost: ¥19,400,000、Indirect Cost: ¥5,820,000)
• Keywords: 立体構造 / クライオ電子顕微鏡 / トモグラフィー / 単粒子解析 / X線結晶構造解析

Outline of Research at the Start

本研究では非ドメイン型バイオポリマーが形成する非膜オルガネラの内部構造や、実際にそれらの分子が機能する際の構造を、構造生物学の視点から明らかにする。クライオ電子トモグラフィー解析を行って内部の微細構造並びに非ドメイン型バイオポリマーの非膜オルガネラ内の配置を調べる。得られた情報を基により詳細な部分構造解析・相互作用解析を行うほか、質量分析を用いた解析や計算機を用いた解析を相互に参照し、種間で保存された配列を持たない分子がどのようにして分子機能を発揮するのか、その法則の検証を行う。

Outline of Annual Research Achievements

伊藤は非膜オルガネラのトモグラフィー解析が難航したため、クライオ電子トモグラフィー測定に適した古細菌試料を用いてトモグラム再構成とその解析を推進した。試料をグリッド上に集積させ凍結し、FIB-SEM装置を用いて薄膜化し、クライオTEM装置によりクライオ電子トモグラフィー測定を行い、解釈可能な3次元構造トモグラムを再構成することに成功した。現在セグメンテーション解析を進行中である。それと同時に植物リボソームがホウ素濃度に応じて翻訳制御する機構をクライオ電子顕微鏡による立体構造解析と生化学解析により明らかにし、Nature Chemical Biology誌に報告した。
西増は原核生物のトランスポゾンにコードされたIS110リコンビナーゼの機能構造解析を推進した。機能解析の結果、大腸菌ゲノムのIS110領域から、IS110リコンビナーゼと非コードRNA（bridge RNA；bRNA）が産生されること、および、IS110リコンビナーゼはbRNAと複合体を形成し、bRNAと相補的なドナーDNAおよびターゲットDNAの間の組換え反応を触媒することが明らかになった。すなわち、IS110リコンビナーゼは前例のないRNA依存性DNA組換え酵素であることを発見した。さらに、クライオ電子顕微鏡解析を用いて、IS110リコンビナーゼ-bRNA-ドナーDNA-ターゲットDNA複合体の立体構造を決定し、RNA依存性DNA組換えメカニズムを解明した。IS110リコンビナーゼはプログラム可能なDNA組換え酵素であり、Cas9などでは不可能だった長鎖DNA組込みなどのゲノム改変技術に利用できるため、生命科学分野に絶大なインパクトを与えると考えられる。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

伊藤も西増も順調に成果を出している。

Strategy for Future Research Activity

伊藤は古細菌のトモグラフィー解析を進め、これまでに見出されていなかった古細菌特異的な新規構造体の立体構造解析を進める。セグメンテーション解析に留まらず、可能であればサブトモグラム平均化の解析へと進める。また、それと同時に真核生物の細胞内構造解析、特に非膜オルガネラとERやミトコンドリアの膜状に局在する分子集合体のクライオ電子トモグラフィー解析を目指す。これらに関しては、細胞内解析が困難な場合においては抽出液から租精製した試料のトモグラフィー解析も試みる。
西増のこれまでの研究により、IS110リコンビナーゼが触媒するドナーDNAのターゲットDNAへの組込み反応のメカニズムは明らかになったが、IS110領域から環状ドナーDNAが切り出される反応の詳細は不明である。そこで、今後は、IS110リコンビナーゼによるドナーDNA切り出し反応のメカニズムの解明を目指し、構造機能解析を進める。また、配列解析の結果、IS110ファミリーリコンビナーゼは性質の異なる多様なオルソログからなることが示唆されているため、今後はIS110オルソログの機能構造解析を進め、IS110ファミリーリコンビナーゼの多様性を解明する。

Research Products

• [Int'l Joint Research] Justus-Liebig University(ドイツ)
• [Int'l Joint Research] Massachusetts Institute of Technology/National Institutes of Health(米国)
• [Int'l Joint Research] Justus-Liebig University(ドイツ)
• [Journal Article] Boric acid intercepts 80S ribosome migration from AUG-stop by stabilizing eRF1 (2024)
  • Author(s): Tanaka Mayuki、Yokoyama Takeshi、Saito Hironori、Nishimoto Madoka、Tsuda Kengo、Sotta Naoyuki、Shigematsu Hideki、Shirouzu Mikako、Iwasaki Shintaro、Ito Takuhiro、Fujiwara Toru
  • Journal Title: Nature Chemical Biology Volume: in press Issue: 5 Pages: 0-0
  • DOI: 10.1038/s41589-023-01513-0
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] Switching on stress (2023)
  • Author(s): Kashiwagi Kazuhiro、Ito Takuhiro
  • Journal Title: Nature Chemical Biology Volume: 20 Issue: 4 Pages: 394-395
  • DOI: 10.1038/s41589-023-01436-w
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] Protection of eIF2B from inhibitory phosphorylated eIF2: A viral strategy to maintain mRNA translation during the PKR-triggered integrated stress response (2023)
  • Author(s): Ito Takuhiro、Wuerth Jennifer Deborah、Weber Friedemann
  • Journal Title: Journal of Biological Chemistry Volume: 299 Issue: 11 Pages: 105287-105287
  • DOI: 10.1016/j.jbc.2023.105287
  • Peer Reviewed / Int'l Joint Research
• [Journal Article] Nondomain biopolymers: Flexible molecular strategies to acquire biological functions (2023)
  • Author(s): Arakawa K, Hirose T, Inada T, Ito T, Kai T, Oyama M, Tomari Y, Yoda T, Nakagawa S.
  • Journal Title: Genes to Cells Volume: 28 Issue: 8 Pages: 539-552
  • DOI: 10.1111/gtc.13050
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] METTL18-mediated histidine methylation of RPL3 modulates translation elongation for proteostasis maintenance (2022)
  • Author(s): Matsuura-Suzuki Eriko、Shimazu Tadahiro、Takahashi Mari、Kotoshiba Kaoru、Suzuki Takehiro、Kashiwagi Kazuhiro、Sohtome Yoshihiro、Akakabe Mai、Sodeoka Mikiko、Dohmae Naoshi、Ito Takuhiro、Shinkai Yoichi、Iwasaki Shintaro
  • Journal Title: eLife Volume: 11 Pages: 1-33
  • DOI: 10.7554/elife.72780
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] RNA-triggered protein cleavage and cell growth arrest by the type III-E CRISPR nuclease-protease (2022)
  • Author(s): Kato Kazuki、Okazaki Sae、Schmitt-Ulms Cian、Jiang Kaiyi、Zhou Wenyuan、Ishikawa Junichiro、Isayama Yukari、Adachi Shungo、Nishizawa Tomohiro、Makarova Kira S.、Koonin Eugene V.、Abudayyeh Omar O.、Gootenberg Jonathan S.、Nishimasu Hiroshi
  • Journal Title: Science Volume: 378 Issue: 6622 Pages: 882-889
  • DOI: 10.1126/science.add7347
  • Peer Reviewed / Int'l Joint Research
• [Journal Article] RNA-activated protein cleavage with a CRISPR-associated endopeptidase (2022)
  • Author(s): Strecker Jonathan、Demircioglu F. Esra、Li David、Faure Guilhem、Wilkinson Max E.、Gootenberg Jonathan S.、Abudayyeh Omar O.、Nishimasu Hiroshi、Macrae Rhiannon K.、Zhang Feng
  • Journal Title: Science Volume: 378 Issue: 6622 Pages: 874-881
  • DOI: 10.1126/science.add7450
  • Peer Reviewed / Int'l Joint Research
• [Journal Article] Structure and engineering of the type III-E CRISPR-Cas7-11 effector complex (2022)
  • Author(s): Kato Kazuki、Zhou Wenyuan、Okazaki Sae、Isayama Yukari、Nishizawa Tomohiro、Gootenberg Jonathan S.、Abudayyeh Omar O.、Nishimasu Hiroshi
  • Journal Title: Cell Volume: 185 Issue: 13 Pages: 2324-2337.e16
  • DOI: 10.1016/j.cell.2022.05.003
  • Peer Reviewed / Int'l Joint Research
• [Journal Article] eIF2B-capturing viral protein NSs suppresses the integrated stress response (2021)
  • Author(s): Kashiwagi Kazuhiro、Shichino Yuichi、Osaki Tatsuya、Sakamoto Ayako、Nishimoto Madoka、Takahashi Mari、Mito Mari、Weber Friedemann、Ikeuchi Yoshiho、Iwasaki Shintaro、Ito Takuhiro
  • Journal Title: Nature Communications Volume: 12 Issue: 1 Pages: 7102-7102
  • DOI: 10.1038/s41467-021-27337-x
  • Peer Reviewed / Open Access / Int'l Joint Research
• [Presentation] Structural mechanism of IS110 bridge recombinases (2024)
  • Author(s): Hiroshi Nishimasu
  • Organizer: Keystone Symposia
  • Int'l Joint Research / Invited
• [Presentation] ホウ酸はeRF1をAサイトで安定化させ、植物80SリボソームのAUG-ストップuORFからの下流への移動を阻止する (2023)
  • Author(s): 伊藤 拓宏
  • Organizer: 第46回日本分子生物学会年会
  • Invited
• [Presentation] サシチョウバエ熱シチリアウイルス由来NSsタンパク質による統合的ストレス応答抑制の構造基盤 (2023)
  • Author(s): 伊藤 拓宏
  • Organizer: 第46回日本分子生物学会年会
  • Invited
• [Presentation] Structure and engineering of CRISPR nuclease-protease (2023)
  • Author(s): Hiroshi Nishimasu
  • Organizer: Frontiers in Genome Engineering
  • Int'l Joint Research / Invited
• [Presentation] Structure, function and engineering of the type III-E CRISPR nuclease-protease complex (2023)
  • Author(s): Hiroshi Nishimasu
  • Organizer: Cold Spring Harbor Asia Conference
  • Int'l Joint Research / Invited
• [Presentation] SFSV NSs protein binds to eIF2B to suppress the integrated stress response (2022)
  • Author(s): Takuhiro Ito
  • Organizer: The 2022 Cold Spring Harbor Laboratory Meetings: Protein Homeostasis in Health and Disease,
  • Int'l Joint Research
• [Presentation] Molecular mechanism of boric acid-dependent translational control with AUG-stop (2022)
  • Author(s): Takuhiro Ito
  • Organizer: The 2022 Cold Spring Harbor Laboratory Meetings: Translational Control
  • Int'l Joint Research
• [Presentation] Molecular mechanism of boric acid-dependent translational control with AUG-stop (2022)
  • Author(s): Takuhiro Ito
  • Organizer: The 30th Tokyo RNA Club
  • Int'l Joint Research / Invited
• [Presentation] Structural biology of the integrated stress response: eIF2B, eIF2 and SFSV NSs (2022)
  • Author(s): Takuhiro Ito
  • Organizer: 33rd Tokyo RNA Club
  • Int'l Joint Research / Invited
• [Presentation] 翻訳マシナリの機能構造解析の現状と展望 (2022)
  • Author(s): 伊藤拓宏
  • Organizer: 第45回日本分子生物学会年会
• [Presentation] eIF2B結合性ウイルスタンパク質NSsによる統合的ストレス応答抑制 (2021)
  • Author(s): 伊藤拓宏
  • Organizer: 第94回日本生化学会大会
• [Presentation] eIF2Bに結合するウイルスタンパク質NSsは統合的ストレス応答を抑制する (2021)
  • Author(s): 伊藤拓宏
  • Organizer: 第44回日本分子生物学会年会