| Project Area | Multi-scale understanding of Self-condensation mechanism driven by Dynamic solution environments |
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| Project/Area Number |
22H05090
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| Research Category |
Grant-in-Aid for Transformative Research Areas (B)
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| Allocation Type | Single-year Grants |
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| Review Section |
Transformative Research Areas, Section (III)
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| Research Institution | Kyoto University |
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Principal Investigator |
関山 直孝 京都大学, 理学研究科, 助教 (50758810)
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| Project Period (FY) |
2022-05-20 – 2025-03-31
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| Project Status |
Granted (Fiscal Year 2024)
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| Budget Amount *help |
¥53,560,000 (Direct Cost: ¥41,200,000、Indirect Cost: ¥12,360,000)
Fiscal Year 2024: ¥15,600,000 (Direct Cost: ¥12,000,000、Indirect Cost: ¥3,600,000)
Fiscal Year 2023: ¥15,990,000 (Direct Cost: ¥12,300,000、Indirect Cost: ¥3,690,000)
Fiscal Year 2022: ¥21,970,000 (Direct Cost: ¥16,900,000、Indirect Cost: ¥5,070,000)
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| Keywords | 液液相分離 / 非膜型オルガネラ / 天然変性タンパク質 / アミロイド線維 / 液-液相分離 / アミロイド線維化 |
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| Outline of Research at the Start |
天然変性タンパク質の自己凝縮過程には、分子を取り囲む動的溶液環境が関与していることがわかってきた。溶液環境の重要性は認識され始めているが、細胞内で膜なしオルガネラやアミロイド線維形成を制御する溶液環境因子はわかっていない。本研究では、天然変性タンパク質の自己凝縮過程を制御する動的溶液環境の網羅的探索を行う。細胞内で形成されるTIA-1顆粒を単離し、その溶媒和構造を明らかにすることで、野生型とALS変異型の比較を行う。化学的環境や物理的環境の摂動を与え、TIA-1顆粒の内部構造がどのように変化するかを解析し、膜なしオルガネラやアミロイド繊維を安定化する動的溶液環境を同定する。
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| Outline of Annual Research Achievements |
天然変性タンパク質の自己凝縮過程には、分子を取り囲む動的な溶液環境が重要な役割を果たしていることが明らかになっている。しかしながら、これまでの研究は主に精製タンパク質を用いたin vitro実験に限られており、細胞内の動的な溶液環境や非膜型オルガネラ、アミロイド線維形成との関係については十分に理解されていない。本研究では、TIA-1の自己凝縮過程を制御する動的溶液環境を網羅的に探索することを目的としている。細胞から抽出した顆粒をin vitro実験系で扱うことにより、生物学的意義のある動的溶液環境の特定につながると考えられる。
初めに、当初予定していた培養条件や実験手法では細胞抽出実験ができないことが分かり、そのために本年度は、TIA-1顆粒を形成する培養条件や実験手法の確立に取り組んだ。最初に、GFP融合TIA-1をHeLa細胞に発現させ、亜ヒ酸ストレスに曝露することでストレス顆粒の形成を誘導し、培地を交換することでストレス顆粒の消失をリアルタイムで観察する実験を行った。次に、FKBP12の変異体でダイマーを形成するFm配列を用いて、細胞内に人工的に凝縮体を形成させる実験を行った。この凝縮体を細胞内に発現させると、細胞がアポトーシスを起こして死滅することを示唆するデータを得た。
また、In vitro実験では、TIA-1の野生型とALS変異型のアミロイド線維構造をクライオ電子顕微鏡により解析した。その結果、ALSに関連する変異がアミロイド線維形成に影響を与えることを示す重要な情報を得た。さらに、TIA-1のアミロイド線維化ドメインを欠損させた実験により、液滴形成とアミロイド線維形成を引き起こすアミノ酸領域は異なることが示された。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
本研究では、培養細胞からTIA-1顆粒を単離し、自己凝縮過程を制御する動的溶液環境の網羅的探索を行うことを目的としている。しかし、細胞培養条件の検討を行っていたところ、当初の予想に反して、予定していた培養条件及び実験手法では細胞抽出実験ができないことが判明した。そのため本年度は、TIA-1顆粒を形成する培養条件や実験手法の確立を行なった。
第一に、細胞内のTIA-1凝縮体の解析を行なった。GFP融合TIA-1をHeLa細胞に発現させ、亜ヒ酸ストレスに曝露することでストレス顆粒の形成を誘導した。その後、培地を交換することでストレス顆粒の消失を引き起こし、その消失過程をリアルタイムで観察することに成功した。
第二に、細胞内での人工凝縮体の形成を行なった。具体的には、FKBP12の変異体でダイマーを形成するFm配列を5つタンデムに繋げた5Fm配列を用いた。これは5Fm配列が多価相互作用することで自発的に凝縮体を形成するもので、5Fm融合TIA-1を細胞内に発現させると、細胞内に様々な大きさの人工凝縮体を形成させることに成功した。さらに5Fm-TIA1を細胞に発現させると、細胞がアポトーシスを起こして死滅することを示唆するデータを得た。
In vitro実験では前年度までに、TIA-1の野生型とALS変異型のアミロイド線維構造をクライオ電子顕微鏡で解析し、TIA-1の天然変性タンパク質領域であるプリオン様ドメインが形成するアミロイド線維構造を調べ、線維形成の可逆性を保証する構造的特徴を発見していた。また、ALSに関連する変異を持つアミロイド線維構造を明らかにし、疾患関連変異がアミロイド線維形成に影響を与えることを示した。加えて、本年度の研究では、TIA-1のアミロイド線維化ドメインを欠損させた実験により、液滴形成とアミロイド線維形成を引き起こすアミノ酸領域は異なることが示唆された。
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| Strategy for Future Research Activity |
今後は、in vitro実験で得られた構造情報と、細胞内のTIA-1顆粒内部の構造情報とを比較するための実験を計画している。このために、GFP融合TIA-1や5Fm融合TIA-1を恒常的に発現させる安定細胞株を作成する。安定細胞株の作成には、T-REx HeLa細胞またはレンチウイルスを用いる。T-REx HeLa細胞は、tetracycline（テトラサイクリン）またはdoxycycline（ドキシサイクリン）などの抗生物質によって制御されるTet-Onシステムを持っているため、特定の遺伝子の発現を抗生物質の添加により誘導することができる。またレンチウイルスも、目的の遺伝子を細胞のゲノムに組み込むことで、遺伝子の発現が安定的に維持されるようになるため、安定細胞株の作成が比較的容易にできる。これらの安定細胞株を使ってTIA-1顆粒の単離を行う予定である。これらの研究により、TIA-1の自己凝縮過程を制御する溶液環境を同定することを目指す。
TIA-1顆粒の単離に成功した後、まずはアミノ酸選択的化学修飾と質量分析法を組み合わせた手法により、細胞から単離したTIA-1顆粒内部の溶媒和構造を明らかにし、野生型とALS変異型の比較を行う。次に、ATPやイオンの添加、超音波や撹拌といった物理的環境の摂動を与え、TIA-1顆粒の溶媒和構造がどのように変化するかを解析し、非膜型オルガネラやアミロイド線維を安定化する動的溶液環境を探索する。また、細胞から抽出した顆粒をin vitro実験系で扱うことにより、細胞内分子の影響を考慮しながら溶液環境を自由に変化させることができるため、生物学的意義のある動的溶液環境の特定につながることが期待される。
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