| Project Area | Creation of multi-scale 4D biology |
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| Project/Area Number |
23H03845
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| Research Category |
Grant-in-Aid for Transformative Research Areas (B)
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| Allocation Type | Single-year Grants |
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| Review Section |
Transformative Research Areas, Section (III)
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| Research Institution | Hiroshima University |
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Principal Investigator |
杉 拓磨 広島大学, 統合生命科学研究科(理), 准教授 (70571305)
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| Project Period (FY) |
2023-04-01 – 2026-03-31
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| Project Status |
Granted (Fiscal Year 2024)
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| Budget Amount *help |
¥38,610,000 (Direct Cost: ¥29,700,000、Indirect Cost: ¥8,910,000)
Fiscal Year 2025: ¥12,870,000 (Direct Cost: ¥9,900,000、Indirect Cost: ¥2,970,000)
Fiscal Year 2024: ¥12,870,000 (Direct Cost: ¥9,900,000、Indirect Cost: ¥2,970,000)
Fiscal Year 2023: ¥12,870,000 (Direct Cost: ¥9,900,000、Indirect Cost: ¥2,970,000)
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| Keywords | ライトフィールド / FLIM / 4D生物学 / ライトフィールド顕微鏡 / 蛍光寿命イメージング |
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| Outline of Research at the Start |
本申請者は、３Ｄ空間をたった１度のカメラ撮影でスキャンレスに共焦点顕微鏡の1,000倍以上高速でナノ分解能撮影するLF顕微鏡を開発した。さらに、この独自の高分解能LF顕微鏡はデコンボリューション処理など計算負荷の高い処理なく高分解能なため、ミリ秒以下で３Ｄ像を再構成する。本研究では、このLF顕微鏡に対し、細胞内環境をラベルフリーに計測可能な技術である蛍光寿命イメージング法(FLIM)を組み合わせ、たった１度のカメラ撮影で細胞内環境をマルごとシングルショット４Ｄイメージング可能なLF-FLIMを開発し、神経機能の低下機構の解析に応用することを目的とする。
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究では周波数ドメイン方式のFLIMを採用し、これを独自のライトフィールド顕微鏡と統合することを目指す。目的の蛍光寿命が数ナノ秒の場合、それよりも少し長い周期をもつ正弦波(例:80 MHz = 周期12.5ナノ秒)で試料を励起する。蛍光寿命は蛍光分子が励起されてから蛍光を発するまでの時間であることから、励起光に比べ、蛍光寿命の分だけ蛍光の位相は遅れる。また、蛍光寿命が長いと、後の励起光により発光した成分と平均化されることになるため、振幅も小さくなる。したがって、励起光に対する蛍光の遅れをカメラで各画素ごとに検出することにより、位相遅れと変調を記録できる。そこで、まずカメラ感度の変調が40MHzまで可能なPCO社のCCDカメラと連続波レーザーとその変調器を用い、FLIM光学系の構築し、高分解能LF光学系を統合する。高分解能LF顕微鏡ではマイクロレンズアレイを利用することが特徴である。このマイクロレンズアレイを通して、撮影した二次元ライトフィールド(L F)像にはxy平面上の位置座標だけでなく奥行き(z軸)方向の位置座標も埋め込まれているため、1回のカメラ撮影で取得したLF像から独自の三次元再構成アルゴリズムによりミリ秒以下の速度で3D像の再構成が可能である。したがって、このマイクロレンズアレイをFLIM光学系のカメラセンサーの前段に配置する。これにより得られた蛍光寿命情報を三次元的に1回のカメラショットで取得可能になると期待した。結果的には、高分解能LF光学系の構築に成功し、さらにFLIM用カメラを導入するに至った。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
独自の高分解能LF光学系が完成し、FLIM用カメラを導入したため。
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| Strategy for Future Research Activity |
令和5年度構築の光学系を用いて、まず蛍光寿命が既知の蛍光粒子を３Ｄ空間に固定した試料の蛍光寿命イメージングを行う。通常、三次元試料としてはアクリルアミドに蛍光粒子を固定した試料を用いるが、アクリルアミドの乾燥による縮小により長期間の利用が難しい。そこで申請者はポリジメチルシロキサン(PDMS)空間に蛍光粒子を固定することにより、長期間、繰り返し利用可能な三次元試料を開発した。本提案でもこの独自の三次元試料を用い、その蛍光寿命が既知の数字と一致するかを検証する。
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