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[Amyloid and heteroamyloid] Formation of meta-aggregates and their toxicity in mixed dementia

Planned Research

Project AreaSupramolecular behavior and dynamic capture of metastable amyloid aggregates
Project/Area Number 23H03850
Research Category

Grant-in-Aid for Transformative Research Areas (B)

Allocation TypeSingle-year Grants
Review Section Transformative Research Areas, Section (III)
Research InstitutionKanazawa University

Principal Investigator

小野 賢二郎  金沢大学, 医学系, 教授 (70377381)

Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) 辻 まゆみ  昭和大学, 医学部, 教授 (40155544)
Project Period (FY) 2023-04-01 – 2026-03-31
Project Status Granted (Fiscal Year 2024)
Budget Amount *help
¥34,190,000 (Direct Cost: ¥26,300,000、Indirect Cost: ¥7,890,000)
Fiscal Year 2025: ¥11,180,000 (Direct Cost: ¥8,600,000、Indirect Cost: ¥2,580,000)
Fiscal Year 2024: ¥11,180,000 (Direct Cost: ¥8,600,000、Indirect Cost: ¥2,580,000)
Fiscal Year 2023: ¥11,830,000 (Direct Cost: ¥9,100,000、Indirect Cost: ¥2,730,000)
Keywordsメタアグリゲート / アミロイド / オリゴマー / 共凝集
Outline of Research at the Start

アルツハイマー病(AD)では、Aβ、tauの凝集が連続的に起こり、神経細胞死に至る。一方、パーキンソン病(PD)ではαSyn凝集、2型糖尿病ではIAPP凝集が各々病態に関わっている。疫学研究より2型糖尿病がAD及びPDの発症リスクを高めることから、研究代表者は、これらの疾患病態は分子レベルで密接に関わっていると考え、アミロイドの共凝集説を提唱した。本研究では、Aβ、tau、αSyn、IAPPから成るメタアグリゲートの形成および毒性機序を分子レベルで解明することを目的とする。得られる知見は、急増する糖尿病合併型認知症の早期診断法の糸口になり、メタアグリゲート疾患の根本治療を目指すものである。

Outline of Annual Research Achievements

アルツハイマー病(AD)では、アミロイドβ(Aβ)やtauの凝集が関与している。一方、パーキンソン病(PD)ではαシヌクレイン(αSyn)の凝集が、2型糖尿病では膵島アミロイド(IAPP)凝集が各々の病態に関わり相互に関与している可能性が示唆されている。本研究では、各アミロイド(Aβ、tau、αSyn、IAPP)からなるメタアグリゲートの凝集動態や構造、細胞毒性相関を明らかにすることを目的としている。
Aβ42やtau、αSyn、IAPPは種々の検討から各low molecular weight(LMW)画分(主としてモノマーが存在する画分)を効率的に調整することに成功した。これら各蛋白のLMWを用い、チオフラビンT(ThT)を利用した系で各凝集反応を検討し、凝集反応を簡便に評価できることを明らかにした。また、ThTを利用した系で、各蛋白から調整したシードと同じ蛋白のLMWを用いた凝集反応(セルフ・シーディング反応)の場合、いずれの蛋白でも凝集促進効果がみられることを明らかにした。異種のアミロイド蛋白を用いた凝集反応(クロス・シーディング反応)についてThTを利用した系で種々検討したところ、αS-シードとAβ42-LMWとの場合やAβ42-シードとIAPP-LMWとの場合で、その凝集反応が速くなることを見い出した。αS-シードとAβ42-LMWとのクロス・シーディング反応では、高速原子間力顕微鏡(HS-AFM)で動的な線維形成を観察することができた。また、形成された線維について、電子顕微鏡でその形態を、免疫沈降やSDS-PAGEでその構成蛋白を確認した。さらに、SH-SY5Y細胞を用いたMMT法では、αS-シードとAβ42-LMWとのクロス・シーディング反応で形成された線維は、Aβ42-LMWで形成された線維と同程度の神経毒性を示すことが明らかなとなった。

Current Status of Research Progress
Current Status of Research Progress

3: Progress in research has been slightly delayed.

Reason

Aβ42やIAPPは市販のものを用い、tauやαSynは大腸菌から調整した。Aβ42やtau、αSynのLMWはサイズ排除クロマトグラフィー(size exclusion chromatography :SEC)で分離精製した。IAPPは、HFIP (hexafluoroisopropanol)処理にてLMWを調整した。上記の各蛋白のLMWを用いて、37℃下で静置や振動、撹拌などの条件で1~7日間凝集反応を行いThTを利用した系で評価した。また、凝集反応で形成された線維からシードを調整し、セルフあるいはクロス・シーディング反応についてThTを利用した系で評価した。凝集反応やセルフ・シーディング反応については、各蛋白で検討したが、クロス・シーディング反応については、現状ではAβ42とαSあるいは、Aβ42とIAPPで検討して、αS-シードとAβ42-LMWとの場合、あるいは、Aβ42-シードとIAPP-LMWとの場合に凝集促進効果が認められた。これらの結果から、異種間での凝集反応において、適切な蛋白の組み合わせが存在している可能性を考えており、その他の組み合わせについても検討する必要がある。
上記の結果を踏まえ、まず、αS-シードとAβ42-LMWとのクロス・シーディング反応について追加検討を行った。HS-AFMを用いて、そのクロス・シーディング反応を動的に観察することができた。また、形成された線維を経時的に電子顕微鏡で評価したところ、形成される線維はAβ42-LMWのみの場合よりも多くみられた。さらに、クロス・シーディング反応で形成された線維の構成蛋白について、抗αS抗体を用いた免疫沈降およびSDS-PAGEで解析し、αSとAβ42で構成されることを確認した。これらから、αSとAβ42とは異種間でシーディング反応が進行している可能性を考えている。

Strategy for Future Research Activity

αS-シードとAβ42-LMWとの凝集反応で、異種蛋白間でシーディング反応が進行している可能性が示唆された。このことから、まずHS-AFMを用いて、αS-シードからAβ42の直接的な伸長反応が観察されるかについて、反応条件を種々検討する(αS-シードの存在量や、Aβ42濃度など)。次いで、2次構造変化を円二色性(Circular Dichroism: CD)測定で調べる。更に、αSとAβ42とのメタアグリゲート形成能について、光化学架橋 (Photo-induced cross-linking of unmodified proteins: PICUP) 法を用いて混合反応溶液を固定化し、メタアグリゲート分布をSDS電気泳動で調べる。
他のアミロイド蛋白間での共凝集として、Aβ42とIAPPとの組み合わせや、αSとIAPPとの組み合わせについて、同様にThTを利用した系や、電子顕微鏡、CD、HS-AFM、免疫沈降・SDS-PAGEによる解析、神経細胞毒性実験で検討する予定である。

Report

(1 results)
  • 2023 Annual Research Report
  • Research Products

    (72 results)

All 2024 2023

All Journal Article (9 results) (of which Int'l Joint Research: 4 results,  Peer Reviewed: 9 results,  Open Access: 8 results) Presentation (57 results) (of which Int'l Joint Research: 5 results,  Invited: 38 results) Book (6 results)

  • [Journal Article] Extracellular high molecular weight α-synuclein oligomers induce cell death by disrupting the plasma membrane2023

    • Author(s)
      Ito Naohito、Tsuji Mayumi、Adachi Naoki、Nakamura Shiro、Sarkar Avijite Kumer、Ikenaka Kensuke、Aguirre Cesar、Kimura Atsushi Michael、Kiuchi Yuji、Mochizuki Hideki、Teplow David B.、Ono Kenjiro
    • Journal Title

      npj Parkinson's Disease

      Volume: 9 Issue: 1 Pages: 139-139

    • DOI

      10.1038/s41531-023-00583-0

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    • Author(s)
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    • Journal Title

      Frontiers in Pharmacology

      Volume: 14 Pages: 1203349-1203349

    • DOI

      10.3389/fphar.2023.1203349

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    • Journal Title

      International Journal of Molecular Sciences

      Volume: 24 Issue: 4 Pages: 3089-3089

    • DOI

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      Journal of Neurological Science

      Volume: 452 Pages: 120760-120760

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      Volume: 91(2) Issue: 2 Pages: 805-814

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      Volume: 111 Pages: 105445-105445

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      Journal of Alzheimer's Disease

      Volume: 91 Issue: 3 Pages: 1173-1183

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    • Journal Title

      Nano Letters

      Volume: 23 Issue: 13 Pages: 6259-6268

    • DOI

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      International Journal of Molecular Sciences

      Volume: 24 Issue: 12 Pages: 10215-10215

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      10.3390/ijms241210215

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    • Author(s)
      小野賢二郎
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      第42回日本認知症学会学術大会
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  • [Presentation] アルツハイマー病病態における蛋白凝集体の病的意義を考える2023

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      小野賢二郎
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      第42回日本認知症学会学術大会
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      小野賢二郎
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      第53回日本臨床神経生理学会学術大会/第60回日本臨床神経生理学会技術講習会
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      篠原もえ子、小野賢二郎
    • Organizer
      第42回日本認知症学会学術大会
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  • [Presentation] タウオパチーの疾患修飾療法2023

    • Author(s)
      村松大輝、小野賢二郎
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      第64回日本神経病理学会総会学術研究会/第66回日本神経化学学会大会
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  • [Presentation] 高速原子間力顕微鏡を用いたAβプロトフィブリルの構造動態とレカネマブの作用2023

    • Author(s)
      小野賢二郎、中山隆宏、辻まゆみ、梅田健一、小口達敬、紺野宏記、篠原もえ子、木内祐二、古寺哲幸、David B.Teplow
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      第42回日本認知症学会学術大会
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  • [Presentation] Vitamin B12 may inhibit the neurotoxicity of Amyloid beta oligomers and protect memory function2023

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      木村篤史、安本太郎、森友紀子、門馬佑太郎、野原哲人、二村明徳、黒田岳志、笠井英世、金野竜太、稗田宗太郎、Teplow David、辻まゆみ、木内祐二、島田 斉、村上秀友、小野賢二郎
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      第64回日本神経学会学術大会
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  • [Presentation] Effects of Melissa officinalis Extract on cognition in older adults2023

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      Shinohara M, Hamaguchi T, Sakai K, Komatsu J, Iwasa K, Horimoto M, Nakamura H, Yamada M, Ono K
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      第64回日本神経学会学術大会
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  • [Presentation] 血液アミロイドマーカーによるアルツハイマー病理合併レビー小体病の検出2023

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      篠原もえ子、村上秀友、坂下泰浩、森友紀子、小松潤史、村松大輝、疋島貞雄、小野賢二郎
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      第64回日本神経病理学会総会学術研究会/第66回日本神経化学学会大会
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  • [Presentation] 血液によるアルツハイマー病理合併レビー小体病の検出2023

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      篠原もえ子、村上秀友、坂下泰浩、森友紀子、小松潤史、村松大輝、疋島貞雄、小野賢二郎
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  • [Presentation] 血液によるアルツハイマー病理合併レビー小体病の検出2023

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      篠原もえ子、村上英友、坂下泰浩、森友紀子、小松潤史、村松大輝、疋島貞雄、小野賢二郎
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      第42回日本認知症学会学術大会
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  • [Presentation] アミロイドβ凝集体におけるシーディング活性の不活化に関するin vitro研究2023

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      中野博人、浜口 毅、池田篤平、中山隆宏、小野賢二郎、山田正仁
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      第13回日本脳血管・認知症学会総会
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  • [Presentation] Effects of inactivation procedures for seeding activity of amyloid β-protein aggregates2023

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      Nakano H, Hamaguchi T, Ikeda T, Watanabe-Nakayama T, Ono K, Yamada M
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      第41回日本神経治療学会学術集会
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      第42回日本認知症学会学術大会
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      第64回日本神経学会学術大会
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Published: 2023-04-13   Modified: 2025-04-17  

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