| Project Area | Supramolecular behavior and dynamic capture of metastable amyloid aggregates |
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| Project/Area Number |
23H03850
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| Research Category |
Grant-in-Aid for Transformative Research Areas (B)
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| Allocation Type | Single-year Grants |
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| Review Section |
Transformative Research Areas, Section (III)
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| Research Institution | Kanazawa University |
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Principal Investigator |
小野 賢二郎 金沢大学, 医学系, 教授 (70377381)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
辻 まゆみ 昭和医科大学, 医学部, 教授 (40155544)
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| Project Period (FY) |
2023-04-01 – 2026-03-31
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| Project Status |
Granted (Fiscal Year 2025)
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| Budget Amount *help |
¥34,190,000 (Direct Cost: ¥26,300,000、Indirect Cost: ¥7,890,000)
Fiscal Year 2025: ¥11,180,000 (Direct Cost: ¥8,600,000、Indirect Cost: ¥2,580,000)
Fiscal Year 2024: ¥11,180,000 (Direct Cost: ¥8,600,000、Indirect Cost: ¥2,580,000)
Fiscal Year 2023: ¥11,830,000 (Direct Cost: ¥9,100,000、Indirect Cost: ¥2,730,000)
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| Keywords | メタアグリゲート / アミロイド / オリゴマー / 共凝集 |
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| Outline of Research at the Start |
アルツハイマー病（AD）では、Aβ、tauの凝集が連続的に起こり、神経細胞死に至る。一方、パーキンソン病（PD）ではαSyn凝集、2型糖尿病ではIAPP凝集が各々病態に関わっている。疫学研究より2型糖尿病がAD及びPDの発症リスクを高めることから、研究代表者は、これらの疾患病態は分子レベルで密接に関わっていると考え、アミロイドの共凝集説を提唱した。本研究では、Aβ、tau、αSyn、IAPPから成るメタアグリゲートの形成および毒性機序を分子レベルで解明することを目的とする。得られる知見は、急増する糖尿病合併型認知症の早期診断法の糸口になり、メタアグリゲート疾患の根本治療を目指すものである。
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| Outline of Annual Research Achievements |
アルツハイマー病(AD)では、アミロイドβ(Aβ)やtauの凝集が関与している。一方、パーキンソン病(PD)ではαシヌクレイン(αS)の凝集が、2型糖尿病では膵島アミロイド(IAPP)凝集が各々の病態に関わり相互に関与している可能性が示唆されている。本研究では、各アミロイド蛋白（Aβ、tau、αS、IAPP)からなるメタアグリゲートの凝集動態や構造、細胞毒性相関を明らかにすることを目的としている。
昨年度は、Aβ42やtau、αS、IAPPの各low molecular weight(LMW)画分(主としてモノマーが存在する画分)を効率的かつ高い再現性で調整することに成功している。また、各アミロイド蛋白から調整したシードと異種アミロイド蛋白のLMW画分との凝集反応(クロス・シーディング反応)において、チオフラビンT(ThT)を利用することで凝集反応を簡便に評価できることを明らかにしている。検討したクロス・シーディング反応のうち、αS-シードとAβ42-LMWとの組み合わせや、Aβ42-シードとIAPP-LMWとの組み合わせで、その凝集反応促進効果が認められた。
本年度は、αS-シードとAβ42-LMWとのクロス・シーディング反応に着目し、その凝集反応で形成された線維がどのような構造を有しているかを明らかにすることを目的とした。まず、各アミロイド蛋白のLMW画分の蛍光標識体(αS-LMW：赤、Aβ42-LMW:緑)を調整した。次いで、蛍光標識(赤)したαS-LMWからαS-シードを調整し、異なる蛍光色素で標識(緑)したAβ42-LMWとのクロス・シーディングを行い、形成された線維を経時的に蛍光顕微鏡で観察した。その結果、時間の経過に伴いαS-シード(赤)周囲に線維状のAβ42(緑)が出現し、その一部には混合した蛍光(黄)が認められ、αS-シードとAβ42線維との共凝集体を直接観察することに成功した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
Aβ42や蛍光標識(緑)を有するAβ42は市販のものを用い、αSは大腸菌から調整した。またN122C変異-αSを大腸菌から調整し、そのシステイン側鎖に蛍光色素(赤)を化学修飾することで蛍光標識(緑)したαSを調整した。Aβ42-LMWやαS-LMW、蛍光標識(赤)したαS-LMWはサイズ排除クロマトグラフィー(size exclusion chromatography :SEC)で分離精製した。なお蛍光標識したαS-LMWを調整する際、N122C変異-αSの二量体形成が起こり効率的に単量体を調整することに時間を要し、進捗に遅延が生じた。αS-シードは、蛍光標識したαS-LMWと蛍光標識のない野生型αS-LMWとを混合(1:19)し、37℃下ガラスビーズ存在下で7日間振とうすることで調整した。
上記で調整した蛍光標識(赤)のαS-シードと蛍光標識(緑)を有するAβ42-LMW[蛍光標識(緑)を有するAβ42と蛍光標識のないAβ42-LMWを1:19で混合]とを用い、37℃で静置しクロス・シーディング反応を行った。経時的に反応液の一部を取り、蛍光顕微鏡で形成された線維の蛍光を観察することを計画したが、蛍光顕微鏡を用いた観察において、再現性のある観察法を確立することに時間を要し、進捗に遅延が生じた。種々の検討により再現性のある観察条件を見出すことに成功した。この手法を用いてクロス・シーディング反応を経時的に評価したところ、反応開始直後には蛍光標識(赤)したαS-シードのみの蛍光(赤)が観察されたが、数時間後にはシード周囲に蛍光標識(緑)を有するAβ42の線維が出現し、その一部には混合した蛍光(黄)が観察され、αS-シードとAβ42線維の共凝集体を直接観察することに成功した。しかし現在用いている蛍光顕微鏡ではこれ以上の解像度での観察が困難であり、共凝集体の詳細な構造の評価はできなかった。
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| Strategy for Future Research Activity |
蛍光顕微鏡を用いて、αS-シードとAβ42-LMWとのクロス・シーディング反応で形成された共凝集体を直接観察することに成功したものの、現在用いている蛍光顕微鏡の解像度では詳細な構造評価は困難である。今後は、より解像度の高い蛍光顕微鏡(共焦点顕微鏡や全反射蛍光蛍光顕微鏡)で共凝集体の観察を検討予定である。
また、蛍光標識したアミロイド蛋白と蛍光標識のない同種アミロイド蛋白を混合(1：19)しシード調整や凝集反応に用いているが、蛍光標識が凝集反応に影響を及ぼしている可能性が考えられる。このため、蛍光標識の存在量をできるだけ少なくする必要があり、この点についても今後検討する予定である。その他、蛍光標識したαS-シードやAβ42-LMWとの凝集反応についてThTを利用した系での評価も検討する予定である。
また、他のアミロイド蛋白との組み合わせ(Aβ42とIAPPや、Aβ42とtau)についても蛍光標識を利用した系について検討する予定である。
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