オーキシンデグロン法によるタンパク質寿命操作

• Project Area: Shin-biology regulated by protein lifetime
• Project/Area Number: 23H04925
• Research Category: Grant-in-Aid for Transformative Research Areas (A)
• Allocation Type: Single-year Grants
• Review Section: Transformative Research Areas, Section (III)
• Research Institution: National Institute of Genetics
• Principal Investigator: 鐘巻 将人 国立遺伝学研究所, 遺伝メカニズム研究系, 教授 (20444507)
• Project Period (FY): 2023-04-01 – 2028-03-31
• Project Status: Granted (Fiscal Year 2025)
• Budget Amount: ¥110,370,000 (Direct Cost: ¥84,900,000、Indirect Cost: ¥25,470,000); Fiscal Year 2026: ¥20,020,000 (Direct Cost: ¥15,400,000、Indirect Cost: ¥4,620,000); Fiscal Year 2025: ¥19,500,000 (Direct Cost: ¥15,000,000、Indirect Cost: ¥4,500,000); Fiscal Year 2024: ¥19,370,000 (Direct Cost: ¥14,900,000、Indirect Cost: ¥4,470,000); Fiscal Year 2023: ¥31,200,000 (Direct Cost: ¥24,000,000、Indirect Cost: ¥7,200,000)
• Keywords: タンパク質寿命操作 / デグロン / タンパク質分解 / プロテインノックダウン / 発現制御 / ユビキチン化

Outline of Research at the Start

鐘巻がこれまで開発・改良を重ねてきた、任意タンパク質の分解するAID技術は、人為的タンパク質寿命操作法として理想的な技術である。しかしながら、改良型のAID2を持ってしても、その分解特性に複数の課題がある。これらをAID2の技術的改良により克服し、タンパク質寿命制御の基礎研究における汎用性を拡大し、さらには臨床応用の可能性を開く。

Outline of Annual Research Achievements

AID2をベースにしたナノボディ抗体を使って標的タンパク質を認識、分解誘導する、単鎖抗体AID2の開発を進めた。必要なコンポーネントを全てコードするall-in-oneプラスミドを作成し、GFPナノボディを利用して、GFP付加した複数のタンパク質の分解をテストした。その結果、比較的発現量が低いタンパク質であれば、90%以上を分解除去できることが明らかになった。さらにp53やRASに対する単鎖抗体を利用して、内在性のこれら因子を分解できることを見出した。
次にマウスでAID2を利用するために、受精卵を利用してROSA26座にOsTIR1(F74G)の導入を試みたが、うまくノックインされたマウスラインが得られなかった。そこで、ES細胞に導入する方法で進めている。mAID-GFPレポーターをROSA26に導入したマウスラインの作成は成功した。脳内分解に向けた分解誘導化合物のスクリーニングは、20種類近く新規化合物を試したが、5-Ph-IAAを超える分解誘導能をもつものは得られなかった。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

昨年度は単鎖抗体を用いた改良AID2を細胞レベルで検証し、GFP付加タンパク質、p53、RASなどを標的に分解誘導に成功した。AID2のマウスへの応用に関しては、mAID-GFPレポーターを発現するマウスの樹立に成功した。

Strategy for Future Research Activity

単鎖抗体AID2法を細胞レベルでより検証するとともに、線虫、マウスなど動物個体への応用をテストする。マウスに関しては、ROSA26座にOsTIR1(F74G)を導入したラインの確立する。脳内分解誘導用のリガンドに関しては、新規アナログをテストして検証する。

Research Products

• [Int'l Joint Research] Vanderbilt University/University of Pennsylvania/Harvard Medical School(米国)
• [Int'l Joint Research] University of Edinburgh/University of Manchester/University of Dundee(英国)
• [Journal Article] Overexpression of JNK-associated leucine zipper protein induces chromosomal instability through interaction with dynein light intermediate chain 1 (2024)
  • Author(s): Ryusuke Suzuki, Masato T Kanemaki, Takeshi Suzuki, Katsuji Yoshioka
  • Journal Title: Genes to Cells Volume: 29 Issue: 1 Pages: 39-51
  • DOI: 10.1111/gtc.13083
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] Ran-GTP assembles a specialized spindle structure for accurate chromosome segregation in medaka early embryos (2024)
  • Author(s): Kiyomitsu Ai、Nishimura Toshiya、Hwang Shiang Jyi、Ansai Satoshi、Kanemaki Masato T.、Tanaka Minoru、Kiyomitsu Tomomi
  • Journal Title: Nature Communications Volume: 15 Issue: 1 Pages: 981-981
  • DOI: 10.1038/s41467-024-45251-w
  • Peer Reviewed / Open Access / Int'l Joint Research
• [Journal Article] Depletion of lamins B1 and B2 promotes chromatin mobility and induces differential gene expression by a mesoscale-motion-dependent mechanism (2024)
  • Author(s): Pujadas Liwag Emily M.、Wei Xiaolong、Acosta Nicolas、Carter Lucas M.、Yang Jiekun、Almassalha Luay M.、Jain Surbhi、Daneshkhah Ali、Rao Suhas S. P.、Seker-Polat Fidan、MacQuarrie Kyle L.、Ibarra Joe、Agrawal Vasundhara、Aiden Erez Lieberman、Kanemaki Masato T.、Backman Vadim、Adli Mazhar
  • Journal Title: Genome Biology Volume: 25 Issue: 1 Pages: 77-77
  • DOI: 10.1186/s13059-024-03212-y
  • Peer Reviewed / Open Access / Int'l Joint Research
• [Journal Article] RAD51 bypasses the CMG helicase to promote replication fork reversal (2023)
  • Author(s): Liu Wenpeng、Saito Yuichiro、Jackson Jessica、Bhowmick Rahul、Kanemaki Masato T.、Vindigni Alessandro、Cortez David
  • Journal Title: Science Volume: 380 Issue: 6643 Pages: 382-387
  • DOI: 10.1126/science.add7328
  • Peer Reviewed / Int'l Joint Research
• [Journal Article] The assembly of the MCM2?7 hetero-hexamer and its significance in DNA replication (2023)
  • Author(s): Hatoyama Yuki、Kanemaki Masato T.
  • Journal Title: Biochemical Society Transactions Volume: 51 Issue: 3 Pages: 1289-1295
  • DOI: 10.1042/bst20221465
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] High-throughput Oligopaint screen identifies druggable 3D genome regulators (2023)
  • Author(s): Park DS.、Nguyen SC.、Isenhart R、Shah PP.、Kim W、Barnett RJ、Chandra A、Luppino JM.、Harke J、Wai M、Walsh PJ.、Abdill RJ.、Yang R、Lan Y、Yoon S、Yunker R、Kanemaki MT.、Vahedi G、Phillips-Cremins JE.、Jain R、Joyce EF.
  • Journal Title: Nature Volume: 620 Issue: 7972 Pages: 209-217
  • DOI: 10.1038/s41586-023-06340-w
  • Peer Reviewed / Int'l Joint Research
• [Journal Article] In silico protein interaction screening uncovers DONSON’s role in replication initiation (2023)
  • Author(s): Lim Yang、Tamayo-Orrego Lukas、Schmid Ernst、Tarnauskaite Zygimante、Kochenova Olga V.、Gruar Rhian、Muramatsu Sachiko、Lynch Luke、Schlie Aitana Verdu、Carroll Paula L.、Chistol Gheorghe、Reijns Martin A. M.、Kanemaki Masato T.、Jackson Andrew P.、Walter Johannes C.
  • Journal Title: Science Volume: 381 Issue: 6664
  • DOI: 10.1126/science.adi3448
  • Peer Reviewed / Int'l Joint Research
• [Journal Article] TRAIP resolves DNA replication-transcription conflicts during the S-phase of unperturbed cells (2023)
  • Author(s): Scaramuzza Shaun、Jones Rebecca M.、Sadurni Martina Muste、Reynolds-Winczura Alicja、Poovathumkadavil Divyasree、Farrell Abigail、Natsume Toyoaki、Rojas Patricia、Cuesta Cyntia Fernandez、Kanemaki Masato T.、Saponaro Marco、Gambus Agnieszka
  • Journal Title: Nature Communications Volume: 14 Issue: 1 Pages: 5071-5071
  • DOI: 10.1038/s41467-023-40695-y
  • Peer Reviewed / Open Access / Int'l Joint Research
• [Presentation] A targeted protein knockdown with the power of plants (2023)
  • Author(s): Masato Kanemaki
  • Organizer: TDP Japan (Shonan iPark, Japan)
  • Int'l Joint Research / Invited
• [Presentation] The mechanism defining replication initiation zone in human cells (2023)
  • Author(s): Masato Kanemaki
  • Organizer: CSHL meeting on DNA replication (NY, USA)
  • Int'l Joint Research
• [Presentation] Replication initiation in human cells (2023)
  • Author(s): 鐘巻将人
  • Organizer: 日本生化学会年会（福岡）
• [Presentation] Targeted protein degradation with the power of plant (2023)
  • Author(s): 鐘巻将人
  • Organizer: MBSJ2023（神戸）