| Project Area | Dynamic reproductive lifespan: Life-long changes and fluctuations in germ cell function and risk for next generation |
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| Project/Area Number |
23H04951
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| Research Category |
Grant-in-Aid for Transformative Research Areas (A)
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| Allocation Type | Single-year Grants |
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| Review Section |
Transformative Research Areas, Section (III)
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| Research Institution | University of Tsukuba |
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Principal Investigator |
石川 香 筑波大学, 生命環境系, 准教授 (40734827)
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| Project Period (FY) |
2023-04-01 – 2028-03-31
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| Project Status |
Granted (Fiscal Year 2024)
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| Budget Amount *help |
¥105,300,000 (Direct Cost: ¥81,000,000、Indirect Cost: ¥24,300,000)
Fiscal Year 2024: ¥18,850,000 (Direct Cost: ¥14,500,000、Indirect Cost: ¥4,350,000)
Fiscal Year 2023: ¥30,160,000 (Direct Cost: ¥23,200,000、Indirect Cost: ¥6,960,000)
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| Keywords | ミトコンドリア / 卵成熟 / 突然変異 / mtDNA / 消失 / 変異型mtDNA / 卵胞 / 生殖系列 / 配偶子形成 / ミトコンドリアDNA / 淘汰 |
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| Outline of Research at the Start |
本研究課題では、変異型mtDNAが消失するしくみを解明して、mtDNAが次世代にどのように安定的に伝達され、維持されているのかを理解することを目指す。母性遺伝であるmtDNAの質は、次世代の安定的な発生や成長を担保する重要な要素であるにもかかわらず、mtDNAに人為的な変異を導入することが困難であることから、逆遺伝学的な検証がほとんど行われていない。申請者の変異型mtDNAを有するマウスはその検証を可能にする極めて魅力的なツールである。本研究はこのツールを活用して、次世代におけるミトコンドリアゲノムの安定性という独自の視点から生殖ライフスパンの維持や調節の機構を理解することに貢献する。
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| Outline of Annual Research Achievements |
突然変異型mtDNAが雌マウスの加齢に従って次世代に伝わりにくくなる現象のメカニズム解明を目指し、以下の実験を行った。
①卵巣の組織学的解析：様々な日齢のマウスの卵巣を摘出し、中心付近を連続切片にして原始卵胞～成熟卵胞までの数をカウントした。野生型と変異型mtDNAを有するマウスとの間で、どの時点でも卵胞の数に有意差はなかった。このことから、変異型mtDNAを有することによってある決まった時期に特定の成熟段階で一斉に卵胞が消滅したり、成熟が進まなくなってあるステージのものが増えたりするといった現象は起きていないと考えられた。
②単一卵細胞の変異型mtDNA含有率の定量：様々な日齢のマウスの卵巣を酵素によって分散し、様々な発達段階の卵細胞を一つずつ採取して、個々の卵細胞に含まれる変異型mtDNAの割合を定量した。その結果、変異型mtDNAはマウスの日齢に伴って減少していく傾向が認められたが、未成熟な小さい卵と、成熟が進んだ大きい卵では、減少の傾向が異なっていた。このことは、未成熟卵と成熟卵では異なる機構によって変異型mtDNAの割合が制御されている可能性を示唆している。
これらの結果を受け、日齢ごとに未成熟卵と成熟卵で遺伝子発現パターンが異なっている可能性を考慮し、今後はSingle cell RNAseqによる遺伝子発現解析を実施する予定である。
また、mtDNAがオルガネラレベルで除去されている可能性を検証するためのオートファジー頻度の検証にも一部着手した。今後、実験系を確立して再現性の高い条件で比較検討を行っていきたい。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
未成熟卵と成熟卵で異なる機構が作用している可能性に行きつけたという点は大きな進捗である。成体期以降の雌マウスの卵巣は幼若マウスのものと比較して分散がしにくく、特に未成熟卵の単離・解析が技術的に困難であるが、顕微鏡下Hand pickによってその課題を何とか解決できた点も大きい。本研究は変異型mtDNAを有するマウスの準備が律速になる部分もあり、なかなかスピーディに進めるのが困難であるが、今後も地道に着々と進めていきたい。
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| Strategy for Future Research Activity |
まずは様々な日齢の卵巣から得た未成熟卵・成熟卵の遺伝子発現をSingle cellレベルで比較することを目指す。年度末に実施したPilot試験では、特に未成熟卵の扱いと回収に大きな課題があることがわかった。その解決は容易ではないと考えているが、何とか解析可能なレベルまで実験系を構築し、今年度中の解析実施を目指したい。
さらに、mtDNAが分子レベルで何らかの方法によって識別されている可能性を検討するために、mtDNAの調節領域であるD-loop領域の配列を比較する予定である。
変異型mtDNAがオルガネラレベルで除去されている可能性を検証するため、オートファジー頻度の検証も実施していく。
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