| Project Area | Photosynthesis ubiquity: Supramolecular complexes and their regulations to enable photosynthesis all around the globe |
|---|
| Project/Area Number |
23H04959
|
|---|
| Research Category |
Grant-in-Aid for Transformative Research Areas (A)
|
| Allocation Type | Single-year Grants |
|---|
| Review Section |
Transformative Research Areas, Section (III)
|
|---|
| Research Institution | Okayama University |
|---|
Principal Investigator |
坂本 亘 岡山大学, 先鋭研究領域, 教授 (20222002)
|
|---|
| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
小澤 真一郎 岡山大学, 先鋭研究領域, 准教授 (80717538)
|
|---|
| Project Period (FY) |
2023-04-01 – 2028-03-31
|
| Project Status |
Granted (Fiscal Year 2026)
|
| Budget Amount *help |
¥111,540,000 (Direct Cost: ¥85,800,000、Indirect Cost: ¥25,740,000)
Fiscal Year 2026: ¥18,980,000 (Direct Cost: ¥14,600,000、Indirect Cost: ¥4,380,000)
Fiscal Year 2025: ¥18,590,000 (Direct Cost: ¥14,300,000、Indirect Cost: ¥4,290,000)
Fiscal Year 2024: ¥18,330,000 (Direct Cost: ¥14,100,000、Indirect Cost: ¥4,230,000)
Fiscal Year 2023: ¥36,400,000 (Direct Cost: ¥28,000,000、Indirect Cost: ¥8,400,000)
|
|---|
| Keywords | チラコイド膜 / 膜リモデリング / 葉緑体 / 光合成 / タンパク質 |
|---|
| Outline of Research at the Start |
本研究では、ユビキタスな光合成超分子複合体の足場となるチラコイド膜の形成と維持（＝リモデリング）に着目する。膜リモデリング超分子の構造に基づき、光合成生物が獲得したチラコイド膜の時空間的配置を司るメカニズムを詳らかにする。最近構造が明らかになったVIPP1タンパク質を中心に、膜リモデリング分子とチラコイド膜の構造生理、生化学的な研究を融合的に進め、光合成ユビキティを達成した環境適応機構を解明する。膜リモデリング超分子について、構造学的あるいは生化学的な従来までの研究にとどまらず、他の研究班との融合研究を実施し，光合成ユビキティを可能にしたチラコイド膜レベルでの環境適応原理を解明する。
|
| Outline of Annual Research Achievements |
本研究では、光合成の光エネルギー変換反応の足場となる、チラコイド膜の形成と維持のメカニズムを明らかにする。特にチラコイド膜リモデリングの主要分子VIPP1タンパク質に着目し以下の解析を進めた。
（１）VIPP1-GFPオリゴマーの可視化とin situ構造解析：タバコでVIPP1-GFPを過剰発現する個体を詳細に解析した。化学固定切片を作成してTEM観察でVIPP1オリゴマーを検出し、トモグラフィーにより３次元構造の同定に成功した。
（２）VIPP1ダイナミクスの観察：VIPP1-GFPを発現する個体では、ストレスに応答したVIPP1オリゴマーの脱会合・再会合が観察された。高温処理でVIPP1オリゴマーがフィラメント状の構造を突出させオリゴマーが脱会合する様々なタイムラプス像が得られた。シロイヌナズナでVIPP1に様々な変異を導入した個体でもこれらのダイナミクスを観察した。
（３）VIPP1タンパク質の精製と相互作用因子の解析：VIPP1-Hisに代わりVIPP1-GFP発現タバコ個体でVIPP1-GFPの精製を試みたところ、ショ糖密度勾配遠心によりVIPP1-GFPが濃縮された分画を得ることができ、フィラメント状の構造を取ることが明らかになった。GFP-trap免疫沈降で同定されたVIPP1との相互作用タンパク質を２つ同定し、機能解析を進めた。
（４）タンパク質翻訳後修飾の解析：緑藻クラミドモナスにおいてLHCSR3とLHCA3/LHCA5の化学架橋産物を同定し、酸化が顕著な外縁部LHCIサブユニットが光ストレスに応答し可塑的に機能拡張を行う構造を提案した。b6f複合体とプラストシアニンの翻訳後修飾も同定した。シトクロムb6f複合体の電子伝達状態に応じた表面電荷状態は理論化学的な検証が必要なことに加えて、実験的に構造情報を得て再びアプローチすることが有効であることが判明した。
|
| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
今年度はVIPP1-GFPタバコ個体の解析に集中し、トモグラフィーでの可視化に成功し、その結果を論文として投稿することができた。トモグラフィー解析のためのデータ取得と3Dセグメント解析などの実験系を確立することができた。今後、この系をCorrelative Light and Electron Micrography (CLEM)を用いたクライオET解析に持ち込むことをA01栗栖班との共同研究で進めており、来年度以降、これまで報告例のないin situでのVIPP1オリゴマー可視化と機能解析が進むと期待される。
本研究ではVIPP1-HisとVIPP1-GFPを用いた解析を進めたが、VIPP1タンパク質の精製にはVIPP1-Hisでは良好な結果が得られないことがわかってきた。今後はVIPP1-GFPに集中して上記のCLEM解析を行うとともに、VIPP1-GFPの精製が一部成功したので、これらをクライオ電顕の単粒子解析（繊維解析）に用いるための準備を進める。これらのin vitroとin vivoでの解析を併用しながら膜リモデリング分子によるチラコイド膜維持の機能について今後詳しく調べる。
|
| Strategy for Future Research Activity |
VIPP1の単粒子解析を視野に入れたHisタグによる精製は、精製のためには大量の植物育成が必要であるにも関わらず、均一な超複合体が得られず、予想していたよりも困難であることが明らかになった。このため、今後の構造解析はタバコVIPP1-GFP個体に集中して構造解析を進める。
A01栗栖班との共同研究では、CLEM解析のためのボトルネックとなるFIB-SEMを用いた超薄切片の作成にも目処が立ち、来年度以降クライオETによる解析を行う予定である。ET解析ではチラコイド膜の構造解析も可能になるので、これまでに報告例のない植物葉緑体からのチラコイド膜観察についても積極的に解析を進める。更に、ショ糖密度勾配遠心からはVIPP1-GFPが非常に大きな複合体を形成し、他のタンパク質複合体と分離されたフラクションが得られている。これらの単粒子解析も今後並行して解析を進める。
構造以外の解析では、今後、相互作用因子解析に軸足をシフトして研究を進める。候補の因子として、HSP70やMFP1が得られている。海外でも同様の因子の解析を進めているグループがあるため、今後、これらの解析に集中して研究を進める。
膜リモデリング分子の研究はVIPP1を対象に研究を行っているが、今後、FZLやCURT1など他のリモデリング分子についてもGFPタグを用いた研究を始め、領域の後半でこれらの研究を行うことができるよう準備を進めていく。
|
