| Project Area | Biological cluster: dynamic assembly and functional properties of supramolecular complexes in cells |
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| Project/Area Number |
24H02285
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| Research Category |
Grant-in-Aid for Transformative Research Areas (A)
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| Allocation Type | Single-year Grants |
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| Review Section |
Transformative Research Areas, Section (III)
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| Research Institution | University of Yamanashi |
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Principal Investigator |
小田 賢幸 山梨大学, 大学院総合研究部, 教授 (20569090)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
久住 聡 鹿児島大学, 医歯学域医学系, 助教 (00758039)
加藤 貴之 大阪大学, 蛋白質研究所, 教授 (20423155)
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| Project Period (FY) |
2024-04-01 – 2029-03-31
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| Project Status |
Granted (Fiscal Year 2025)
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| Budget Amount *help |
¥174,200,000 (Direct Cost: ¥134,000,000、Indirect Cost: ¥40,200,000)
Fiscal Year 2025: ¥33,410,000 (Direct Cost: ¥25,700,000、Indirect Cost: ¥7,710,000)
Fiscal Year 2024: ¥44,720,000 (Direct Cost: ¥34,400,000、Indirect Cost: ¥10,320,000)
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| Keywords | クライオ電子顕微鏡 / トモグラフィー |
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| Outline of Research at the Start |
本研究では、細胞内で特定の機能を果たす超分子集合体「バイオロジカルクラスター」の形成メカニズムと特性の解明を目的としています。このクラスターは細胞内で高度に組織化され、多様な分子が複雑に組み合わさっています。本研究はクライオ電子顕微鏡とSEM-CLEMという最先端技術を駆使し、クラスターの三次元構造を可視化します。先進的なデータ解析技術を利用して、バイオロジカルクラスターの動的な挙動や構造変化を捉えることで、細胞生物学と構造生物学の学際領域における新たな地平を開きます。
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| Outline of Annual Research Achievements |
ヒトメラノーマ細胞から単離精製したPMELアミロイドをクライオ電子顕微鏡を用いて1.79Aの超高解像度構造を決定し、野生型では2つの異なる構造多形を、G175S変異体では安定化した別様式のアミロイド構造を確認した。G175S変異により新たにSer175-Tyr159間の水素結合が形成され、アミロイド形成効率が約4倍に増加すること、細胞内外へのアミロイド蓄積量も著増することを明らかにした。一方で、メラニン量やメラノソーム構造には大きな変化は見られず、アミロイド構造異常が選択的に蓄積を引き起こすことが示唆された。PMEL遺伝子のG175S変異は色素性緑内障につながる色素拡散症候群の原因変異とされており、クライオ電子顕微鏡による構造解析がマクロな症状の病態解明に寄与したと言える。(Yanagisawa et al Nat Comm. in press)。
クライオ光学顕微鏡とクライオ電子顕微鏡を用い、CLEM技術とトモグラフィー技術によって、葉状仮足内のアクチンフィラメントの可視化に成功した(Inaba et al iScience 2025)。
FIB切削技術も向上し(Aoyama et al Microscopy 2025)、さらに2024年度、FIB-SEMに供給する窒素ガス配管工事とFIB-SEM内部への光学顕微鏡の導入により、FIB-SEMをクライオ環境下で36時間連続運転し、その間に、半自動で15um幅のラメラ、26個の切削と切削後の蛍光観察に成功している。
走査電子顕微鏡(SEM)を用い、三次元的な分子局在解析の技術開発を行った。光電子相関顕微鏡法(CLEM法)との組合せでは、蛍光3Dイメージングと連続切片SEM法の3Dモデルを比較解析するVolume/3D-CLEM法を確立した。また、近接依存性標識を用いた3D免疫電顕法についても、培養細胞における応用に成功した。現在、これらの手法を用いA01北川班との共同研究を進めている状況である
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
本研究では、予定していたPMELアミロイドの構造解析およびCLEM・クライオFIB-SEM技術の確立が順調に進行し、複数の主要成果が得られた。高解像度構造の決定に加え、細胞内アミロイド挙動の変化や葉状仮足内アクチンの可視化にも成功しており、当初の研究目的に沿って概ね順調に進展している。
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| Strategy for Future Research Activity |
動原体結合型紡錘体のトモグラフィー解析の完遂
昨年度に引き続き、動原体結合型紡錘体の急速凍結サンプルについて、クライオFIB-SEMによるラメラ作製とクライオ電子トモグラフィー（cryo-ET）を実施する。特に、動原体の三次元位置同定にはSerialFIBおよび3DCTを活用したクライオCLEMを適用し、効率的なラメラ作製を行う。得られたトモグラムに対し、ヌクレオソームおよび微小管のテンプレートマッチングを行い、微小管プラス端の空間配置解析を進める。
中心体・PCMの構造解析
単離した中心体サンプルを用いて、クライオFIB-SEMによるラメラ作製または急速凍結連続傾斜像撮影を実施し、トモグラムを再構築する。中心体周辺のPCM構造を高精度に解析するため、サブトモグラム平均化および3D分類によってCep57などのPCM結合タンパク質を抽出・同定する。さらに、ガンマ-チューブリン複合体と連結する高密度構造を基軸として、PCMの外周構造の可視化を試みる。
iPS心筋細胞におけるサルコメア再構築過程の可視化
iPS由来心筋細胞のクライオFIB-SEMトモグラフィー解析を進める。心筋細胞内におけるZ帯の形成過程やアクチン・ミオシンフィラメントの配列回復過程を可視化する。
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