新しい特性を有する酵素の遺伝子解析

Research Project

Project/Area Number	01560087
Research Category	Grant-in-Aid for General Scientific Research (C)
Allocation Type	Single-year Grants
Research Field	応用生物化学・栄養化学
Research Institution	The University of Tokyo
Principal Investigator	丸山芳治東京大学, 農学部, 教授 (60011863)
Co-Investigator(Kenkyū-buntansha)	野澤泰平東京大学, 農学部, 助手 (90180736)
Project Period (FY)	1989
Project Status	Completed (Fiscal Year 1989)
Budget Amount *help	¥1,600,000 (Direct Cost: ¥1,600,000) Fiscal Year 1989: ¥1,600,000 (Direct Cost: ¥1,600,000)
Keywords	生澱粉分解酵素 / プルラナ-ゼ-アミラ-ゼ酵素 / CIー依存性アミラ-ゼ / シグナルペプタイド / homologus region / α-アミラ-ゼ遺伝子 / ニトロゲナ-ゼ / モノクロ-ナル抗体
Research Abstract	(1)新機を有するアミラ-ゼの遺伝生化学的研究本研究室で分離したBacillus circulans F-2はバレイショ生澱粉を分解する酵素(RSDA),cl^-依存性で飽和Naclでも活性の変わらないα-アミラ-ゼ(CDA)やアミラ-ゼとプルラナ-ゼ活性を同等に有する酵素等を生産する。RSDA:pHA300にコ-ドされているRSDA遺伝子をsnbcloningし、dideoxy法により、また、本DNA断片をplasmidに組み替え一連のdeletion mutantを作製し、kilo sequencing法によりDNA塩基配列を完全に決定した。この結果、2508bpのORFを持ち、836のアミノ酸残基からなり、N末端にはsignal sequenceとして34アミノ酸残基を持っていた。アミラ-ゼに共通な活性部位に関係している4つのhomologous regionは主にN末端側に存在していた。また他の生澱粉分解酵素、および結晶性セルロ-ス分解酵素らと共通なthrとser残基を含むregionはC末端側に存在していることが判った。CDA:本遺伝子は1164bpのORF(388アミノ酸)分子量38,005daの蛋白質で20個のsignal配列を持っていることが判った。他のアミラ-ゼとの相同性検索の結果、RSDAと同様に4ヵ所の領域が見つかった。 (2)ニトロゲナ-ゼニトロゲナ-ゼComponent Iに対して特異的に結合するモノクロ-ナル抗体8株(MA1〜8)を取得し、これらの8種の抗体を内からアセチレン還元活性を選択的に阻害するMA1、水素ガス発生活性を選択的に阻害するMA2、両者をともに阻害するMA8を選択した。次に、大腸菌で様々な長さを持つnifD断片を発現させモノクロ-ナル抗体を反応させ塩基配列解析の結果、MA1はComponent IのαサブユニットのN末端に近い領域を、MA2はC末端に近い領域を、MA8はその中間の領域をそれぞれ認識していることが判明した。