日本脳炎ウイルスの感染性cDNAの作製

• Project/Area Number: 01570263
• Research Category: Grant-in-Aid for General Scientific Research (C)
• Allocation Type: Single-year Grants
• Research Field: Virology
• Research Institution: Tokyo Metropolitan Organization for Medical Research
• Principal Investigator: 住吉 日出夫 東京都臨床医学総合研究所, 微生物, 研究員 (80179308)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 相原 忍 東京都臨床医学総合研究所, 微生物, 研究員 (20124430)
• Project Period (FY): 1989
• Project Status: Completed (Fiscal Year 1989)
• Budget Amount: ¥2,000,000 (Direct Cost: ¥2,000,000); Fiscal Year 1989: ¥2,000,000 (Direct Cost: ¥2,000,000)
• Keywords: 日本脳炎ウイルス / RNAウイルス / 感染性cDNA

Research Abstract

日本脳炎ウイルスの感染性cDNAクロ-ンの作製を行ってきた。これまでに得られたcDNA断片をpUCベクタ-を用いてつなぎ合わせ、全ゲノムに相当するクロ-ンを得、T7RNAポリメラ-ゼを用いた系で得られたRNAをAGMK細胞にトランスフェクションすることによりウイルスの回収を試みてきた。RNAを合成する際、その5'末端にはキャップを付け、3'末端は制限酵素とマングビ-ンヌクレア-ゼを用いてゲノムのRNAと同じ5'および3'末端を持つRNAになるように合成した。このRNAはAGMK細胞に対して感染性を示さなかった。そこで感染効率を高めるためRNAをリポソ-ムに包んでトランスフェクションを行った。リポソ-ムを使用することにより、ウイルス粒子から抽出したゲノムRNAは約100倍高い感染性を示したが、試験官内で合成したRNAは感染性を示さなかった。以上のようにこれまでのところ、感染性を示すcDNAおよびRNAは得られていない。
この原因を探るために、構築したcDNAクロ-ンの全塩基配列を再び決定し、以前に決定したゲノムRNAとの一次構造の比較を行った。その結果、異なる塩基配列が存在していることが明らかとなったので、この配列を正しいものに替え、再びクロ-ンを作り直したが感染性を持つものとはならなかった。現在までに解ったことは、全ゲノムに相当するcDNAクロ-ンは、大腸菌内で著しく増えにくく、増えたクロ-ンは既に何等かの変異を起こしており、感染性を失っているということである。現在、ベクタ-をプラスミドからλファ-ジに換えて研究を続けている。