RBタンパク質の機能ドメインの解析

• Project/Area Number: 02152130
• Research Category: Grant-in-Aid for Cancer Research
• Allocation Type: Single-year Grants
• Research Institution: National Cancer Center Research Institute and Research Center for Innovative Oncology, National Cancer Center Hospital East
• Principal Investigator: 田矢 洋一 国立がんセンター研究所, 生物学部, 主任研究官 (60133641)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 西村 暹 国立がんセンター研究所, 生物学部, 部長 (20076970)
• Project Period (FY): 1990 – 1991
• Project Status: Completed (Fiscal Year 1990)
• Budget Amount: ¥4,000,000 (Direct Cost: ¥4,000,000); Fiscal Year 1990: ¥4,000,000 (Direct Cost: ¥4,000,000)
• Keywords: 癌抑制遺伝子 / RBタンパク質 / cdc2キナ-ゼ / リン酸化 / 細胞周期

Research Abstract

我々はRBタンパク質がM期特異的cdc2キナ-ゼによってin vitroでリン酸化されることを以前に示してきたが,in vivoではRBタンパク質のリン酸化はG_1/S期の境界線から始まりM期まで続く。そして,RBタンパク質による増殖抑制活性がこのリン酸化で解除されると推定される。そこで,G_1/S期特異的なものを含むすべてのRBキナ-ゼを検出することを試みた。その過程で,マウスFM3A細胞のcdc2キナ-ゼがMonoSカラムクロマトグラフィ-でG_1/SとG_2/M特異的な2つのピ-クに分かれ,RBキナ-ゼのピ-クはその2つの間に現れることを見出した。RBタンパク質上にはcdc2キナ-ゼの基質になるための共通配列をもつ部位が11ケ所に存在するが,それらの部位を含む合成ペプチドはすべてこのRBキナ-ゼのピ-ク分画でリン酸化された。さらに,このピ-クとほぼ重なる領域にサイクリンAが検出された。一方,RBタンパク質をリン酸化するキナ-ゼが抗RB抗体によってRBタンパク質と共沈殿されることも見出した。その活性は特にG_1/S期に強いこともわかった。以上の結果はG_1/S期にRBタンパク質をリン酸化する酵素がcdc2キナ-ゼであることを示唆しているけれども,in vivoとin vitroでリン酸化部位が一致するか否か,さらに,そのcdc2キナ-ゼに含まれているサイクリンの種類なども今後明らかにせねばならない。また,我々は,RBタンパク質のC末端から317個のアミノ酸をもつポリペプチドを大腸菌で発現させ,これを用いてRBタンパク質に対するモノクロ-ナル抗体を作製することにも成功した。これらの抗体はRBタンパク質の免疫沈降にも使えることがわかった。

Research Products

• [Publications] <Taya,Y.>___ー,Yasuda,H.,Kamijo,M.,Nakaya,K.,Nakamura,Y.,Ohba,Y.& <Nishimura,S.>___ー: "Phosphorylation of the tumor suppressor gene RB protein by Mーphase specific histone H1 kinase" Genetic basis for carcinogenesis:Tumor suppressor genes and oncogenes(Knudson,A.G.Jr.et al.eds.),Japan Sci.Soc.Press,Tokyo/Taylor & Francis Ltd.,London. 171-176 (1990)
• [Publications] Takehara,Nakada,S.,Hara,E.,<Taya,Y.>___ー,Sekiya,S.& Oda,K.: "Interaction of nuclear fractors with the regulatory region of the Nーmyc gene during differentiation of human embryonal carcinoma cells" Gene.
• [Publications] Tamai,K.,Saitoh,S.,Kobayashi,A.,Nishimura,S.& <Taya,Y.>___ー: "Monoclonal antibodies against the human retinoblastoma gene protein"
• [Publications] Kitagawa,M.,Saitoh,S.,Okuyama,A.,Tamai,K.,Ohba,Y.,Yasuda,H.,<Nishimura,S.>___ー& <Taya,Y.>___ー: "The retinoblastoma gene protein is associated with cdc2 kinase"
• [Publications] <Taya,Y.>___ー,Kitagawa,M.,Saitoh,S.,Okuyama,A.,Tamai,K.,Kamijo,M.,Ohba,Y.,Yasuda,H.& <Nishimura,S.>___ー: "Protein kinases for cell cycleーdependent phosphorylation of the retinoblastoma gene protein"