組換えDNA手法によるBHC高分解性微生物の育種

Research Project

Project/Area Number	02202210
Research Category	Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
Allocation Type	Single-year Grants
Research Institution	The University of Tokyo
Principal Investigator	福田雅夫東京大学, 農学部, 助手 (20134512)
Project Period (FY)	1990
Project Status	Completed (Fiscal Year 1990)
Budget Amount *help	¥1,500,000 (Direct Cost: ¥1,500,000) Fiscal Year 1990: ¥1,500,000 (Direct Cost: ¥1,500,000)
Keywords	BHC / 生分解 / 組換えDNA / シュ-ドモナス / 宿主ーベクタ-系 / 広宿主域ベクタ- / 誘導発現システム
Research Abstract	BHC分解菌Pseudomonas paucimobilis株において、DNA組換え微生物の育種の系としての宿主ーベクタ-系を確立することと、同菌由来のBHC分解系遺伝子(linA)の同菌での高発現のシステム構築を目指して以下の成果を達成した。 (1)BHC分解系linA遺伝子の誘導発現システムの構築と発現 alk遺伝子群の制御系にlinA遺伝子を組み込んで構築したlinA遺伝子の誘導発現システムは大腸菌において11倍のBHC分解活性の誘導をもたらした。本システムをP.putidaに導入したところ、酵素活性及び転写物の両者で大腸菌を上回る30倍の誘導高発現が確認された。本システムが広宿主域遺伝子誘導発現システムとして有効であることが示唆され、P.paucimobilis株への応用の基礎となる重要な知見が得られた。 (2)BHC分解菌における宿主ーベクタ-系の構築 linA遺伝子の導入と解析に用いる宿主としてlinA遺伝子欠失株YO5を取得した。また広範なグラム陰性菌で有効な選択マ-カ-を持つ新規の広宿主域ベクタ-pMFY42を作成した。広宿主域ベクタ-をP.paucimobilis株に導入する手段をpMFY42とpVK100を用いた検討した。DNA形質転換法においては形質転換体は得られなかったが、接合伝達法においては接合条件を検討してpVK100を高い頻度で導入することに成功した。この結果、効率的な手法が一応、確立できた。 (3)広宿主域誘導発現システムのUT26株への導入宿主ーベクタ-系が整っていないため本システムのP.paucimobilis株への導入は成功していない。しかし、導入に向けてYO5株の解析を行いBHC分解能欠損がlinA遺伝子活性のみであることを明らかにした。今後はpMFY42系ベクタ-の導入を可能にすることと、1個のベクタ-上に誘導発現システムを集約することを目標と考えている。