| Project/Area Number |
02202221
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| Research Category |
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
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| Allocation Type | Single-year Grants |
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| Research Institution | Nagoya University |
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Principal Investigator |
飯島 信司 名古屋大学, 工学部, 助教授 (00168056)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
魚住 信之 名古屋大学, 工学部, 助手 (40223515)
小林 猛 名古屋大学, 工学部, 教授 (10043324)
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| Project Period (FY) |
1990
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| Project Status |
Completed (Fiscal Year 1990)
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| Budget Amount *help |
¥2,500,000 (Direct Cost: ¥2,500,000)
Fiscal Year 1990: ¥2,500,000 (Direct Cost: ¥2,500,000)
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| Keywords | 硝化脱窒 / 廃水処理 / クロ-ニング / 遺伝子組換え / 環境問題 / 大腸菌 |
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| Research Abstract |
1.前年度にクロ-ン化した亜硝酸還元酵素遺伝子を含むと考えられる11.5kbp <Hind>___ーIII フラグメントをサブクロ-ン化し、詳細な制限酵素地図を作製した。クロ-ニングに使用したオリゴヌクレオチドとクロ-ン化したDNAフラグメントの相同性をサザンハイブリダイゼ-ション法で検討した。この結果オリゴヌクレオチドは、クロ-ン化DNAの端200bpと相同性があることが判明した。そこでこのフラグメント周辺のDNA塩基配列をダイデオキシ法で決定した結果、DNA挿入断片の端から130bp付近にプロ-ブと相補的な塩基配列が存在することがわかった。また塩基配列から推定されるこの前後のアミノ酸配列はさきに精製した酵素のアミノ酸配列と一致し、クロ-ン化されたDNAフラグメントは亜硝酸還元酵素遺伝子に相違ないことが確認された。
2.クロ-ン化した亜硝酸還元酵素遺伝子を<trp>___ーおよび<lacZ>___ープロモ-タ-を含む発現ベクタ-に連結し大腸菌に導入した後、ウエスタンブロッティングにより目的遺伝子産物の発現を検出した。その結果、亜硝酸還元酵素抗原のみかけの分子量は約5万であった。活性型亜硝酸還元酵素の分子量は7万であるので、クロ-ン化したDNAフラグメントは酵素全体の約2/3を含んでいると考えられる。また決定したDNA塩基配列から推定されるアミノ酸配列からこの亜硝酸還元酵素抗原は活性型のN末端側が欠如していると考えられ、本酵素の構造遺伝子は、11.5kb <Hind>___ーIIIフラグメント内の4kbp程度の領域に含まれていると推定された。上記実験全般にわたりプラスミドDNAの大量調整はカゴ型攪拌リアクタ-(培養槽)を使用した。
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