巨大DNA断片特異的PCRによる家族性アルツハイマ-病遺伝子の追究
| Project/Area Number |
02240213
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| Research Category |
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
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| Allocation Type | Single-year Grants |
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| Research Institution | Keio University |
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Principal Investigator |
清水 信義 慶應義塾大学, 医学部, 教授 (50162706)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
工藤 純 慶應義塾大学, 医学部, 助手 (80178003)
蓑島 伸生 慶應義塾大学, 医学部, 助手 (90181966)
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| Project Period (FY) |
1990
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| Project Status |
Completed (Fiscal Year 1990)
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| Budget Amount *help |
¥2,900,000 (Direct Cost: ¥2,900,000)
Fiscal Year 1990: ¥2,900,000 (Direct Cost: ¥2,900,000)
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| Keywords | 巨大DNA断片 / 第21染色体 / セルソ-タ- / パルスフィ-ルド電気泳動 / PCR / SOD / APP / 早発型家族性アルツハイマ-病遺伝子(AD1) |
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| Research Abstract |
常染色体優性遺伝の早発型家族性アルツハイマ-病遺伝子(AD1)をクロ-ニングするために2つの方向からアプロ-チを試みている。1つは現在までにAD1との最も密接な連鎖が報告されているD21S16周辺から新たに多数のDNAマ-カ-を分離することである。このために、ヒトBリンパ球培養細胞からセルソ-タ-を用いてソ-ティングした純粋な第21染色体から巨大DNAを損傷なく抽出し、<Not>___/Iなどの低頻度切断制限酵素で切断後生じた巨大DNA断片をパルスフィ-ルド電気泳動で分離、次に目的とする巨大DNA断片に特異的なクロ-ンをPCRを用いて増幅しクロ-ニングする技術(ショットガンPCR)の確立を試みた。<Alu>___/PCRでは単一コピ-配列のものはほとんど得られなかったが、巨大DNA断片をさらに<Nsp>___/(7524)Iを用いて小断片化し、合成DNAアダプタ-を連結後PCRで増幅する方法では、プロ-ブとして有効なクロ-ンを得られるようになった。もう1つのアプロ-チはメンブレン上に固定した第21染色体DNAへの特異的なハイブリダイゼ-ションとPCRによる増幅を利用して、脳cDNAライブラリ-からAD1候補遺伝子のcDNAをクロ-ニングするというものである。サザンブロット法を用いてハイブリダイゼ-ションの前後でのcDNAの構成比を解析した結果、(1)第21染色体にマップされている遺伝子由来のcDNA(SOD、S100β、APP)はすべて濃縮されており、同時に構成比の均一化の傾向が認められた。(2)他の染色体由来のcDNA(脳型クレアチンキナ-ゼ、ATP合成酵素βサブユニット)はいずれも顕著に減少した。(3)高頻度反復配列(<Alu>___/:5×10^5コピ-、<Kpn>___/Iファミリ-:1×10^4コピ-)を含むcDNA及び28SrRNA由来のcDNAの構成比にはほとんど変化が認められなかった。現在、得られたcDNAクロ-ンの性状を解析中である。
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Report
(1 results)
Research Products
(4 results)
