| Project/Area Number |
02258220
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| Research Category |
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
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| Allocation Type | Single-year Grants |
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| Research Institution | Tokyo University of Science |
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Principal Investigator |
次田 晧 東京理科大学, 総合研究所, 教授 (00028284)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
加茂 政晴 東京理科大学, 総合研究所, 助手 (40214564)
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| Project Period (FY) |
1990 – 1992
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| Project Status |
Completed (Fiscal Year 1990)
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| Budget Amount *help |
¥2,000,000 (Direct Cost: ¥2,000,000)
Fiscal Year 1990: ¥2,000,000 (Direct Cost: ¥2,000,000)
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| Keywords | 転写制御因子 / 超微量蛋白質 / アミノ酸配列 / DNA結合部位 / マウスB細胞 / ホメオドメイン |
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| Research Abstract |
マウスB細胞のDNAのプロモ-タ-及びエンハンサ-に存在するdecamer配列に特異的に結合する因子として、CBFー1(100kDa)及DBFー2(30ー35kDa)の2種類のタンパク質を得えた。DBFー1については、N末端からの一次構造の決定を行い、その知見に基ずいてクロ-ニングを行った。DBFー1のDNA結合部位については、V8プロテア-ゼにより、約3kDaの大きさのDNA結合領域を持つフグメントを得た。次にdTの代わりにBrdUに置換した上述のdecamer配列に、さらに末端にP32で標識しpoly dAを結合したDNAを合成した。DNAと転写制御因子をインキュベ-トしたのち光架橋法により、DNAとタンパク質とを共有結合した。プロテア-ゼでこの複合体を分解後、オリゴdTカラムによりdAのついたDNAを含むペプチドを核抽出液から直接分画して、DNA結合タンパク質フラグメントを得た。最終的な精製をDNAのP32を目印としてSDSーPAGEで行、そのバンドのアミノ酸配列を決定した。その結果このフラグメントは、ホメオドメインの配列とほぼ一致した。マウスDBFー1は、この領域においてヒトのoctamer結合蛋白質とほぼ等しく、decamer結合ホメオドメインが高度に保存されていることを示した。我々の案出した高感度化配列決定法では従来のPTH法と比べて1/50量である100fモルの蛋白試料で市販シ-エンサ-を用いてDNA存在下で10段階のシ-クエンスを決定することが出来た。さらにペプチドと共存するDNAによる阻害は見られない、この方法に改良を加え、アミノ酸同定を妨害する副生成物について研究を行い、試薬のTFAをHFBAに変える事によりその副産物生成を押さえ、HPLCの感度を上げることに成功した。また微量蛋白質の脱塩及び濃縮方法として古典的なTCA沈澱法が有効である事も合わせて示した。5%または20%(w/v)TCAを用いて30分ないしは16時間放置後、沈澱した蛋白質をエ-テルで洗浄してTCAを除去する操作により脱塩を行う方法を確立した。
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