ガングリオシド糖鎖遺伝子と発現制御

• Project/Area Number: 02259106
• Research Category: Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
• Allocation Type: Single-year Grants
• Research Institution: Tokyo Metropolitan Organization for Medical Research
• Principal Investigator: 鈴木 明身 (財)東京都臨床医学総合研究所, 生体膜研究部門, 部長 (70134533)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 鈴木 義之 (財)東京都臨床医学総合研究所, 臨床遺伝学研究部門, 副所長 (90010389) ; 別府 輝彦 東京大学, 農学部, 教授 (80011873) ; 村松 喬 鹿児島大学, 医学部, 教授 (00030891) ; 成松 久 慶応義塾大学, 医学部, 講師 (40129581) ; 牧田 章 北海道大学, 医学部, 教授 (60004561)
• Project Period (FY): 1990 – 1992
• Project Status: Completed (Fiscal Year 1990)
• Budget Amount: ¥24,000,000 (Direct Cost: ¥24,000,000); Fiscal Year 1990: ¥24,000,000 (Direct Cost: ¥24,000,000)
• Keywords: ガングリオシド / 糖鎖遺伝子 / 発現制御 / 糖転移酵素 / 糖糖分解酵素

Research Abstract

ガングリオシド糖鎖発現を制御する遺伝子に関する解析を行い次の成果を得た.ガングリオシドのNーグリコリルノイラミン酸の発現にかかわる水酸化酵素に関する解析を行い,この酵素反応には3つ以上の蛋白が関与し,その一つはcytochrome b5の膜結合部位を失った可溶性の蛋白であることが明らかになった.GM1合成酵素の精製を目的に,基質であるGM2の光感受性アナログを化学合成し,光親和性標識を行った.二次元電気泳動で,pI4.5,分子量40Kの蛋白が標識された.本方法は今後の精製に画期的な成果をもたらすと考えられる.β1ー4ガラクト-ス転移酵素をCOSー1細胞で発現させ,この細胞のノ-ザン解析で,2.0kbのプラスミド由来のバンドが数10倍に,酵素活性は糖タンパク質を基質にして10倍に上昇した.本酵素は0.2%のαーラクトアルブミン存在下でグルコ-スにガラクト-スを転移することが証明された.GM2ガングリオシドの非還元末端構造と同じ構造の糖蛋白糖鎖がSd^a抗原であるとされているが,マウスの小腸より,DBAレクチン結合性の糖蛋白糖鎖を得,その構造を明らかにした.この構造は初期胚のいくつかの細胞に特異的に発現することから今後の展開に期待できる.酵母の外分泌するプロテア-ゼは糖鎖の付加を受けており,糖鎖の修飾が分泌に重要である.糖鎖は79と188のAsnに結合していること,糖鎖を酵素ではずすことにより,酵素活性も修飾を受けることが明らかになった.GM1ガングリオシド蓄積症に関して,分子生物学的解析を行い,6つの異なる遺伝子変異を明らかにした.これらの変異が酵素活性の低下,消失の原因と考えられる.クロ-ン化したαーNーアセチルガラクトサミニダ-ゼcDNAをCOS細胞で発現させ,酵素の性質の検討に成功した.細胞性シアリダ-ゼを精製して,特異的な抗体を得ることが出来た,この抗体を使って,cDNAライブラリ-をスクリ-ニングし,有望なクロ-を得た.

Research Products

• [Publications] K.Kozutsumi,T.Kawano,T.Yamakawa and A.Suzuki: "Participation of cytochrome b5 in CMPーNーacetylneuraminic acid hydroxylation in mouse liver cytosol." J.Biochem.108. 704-706 (1990)
• [Publications] S.Gasa,M.T.Cast,A.Makita,N.Sakakibara and T.Koyamagi: "Presence and characterization of glycolipid sulfotransferase in human serum:Elevated activity in human renal cell carcinoma serum." Eur.J.Biochem.189. 301-316 (1990)
• [Publications] K.Nakazawa,K.Furukawa,A.Kobata and H.Narimatsu: "Characterization of a murine β1ー4galactosyltransferase expressed in COSー1 cells." Eur.J.Biochem.(1991)
• [Publications] Y.Kamada,H.Muramatsu,Y.Arita,T.Yamada and T.Muramatsu: "Structural studies on a binding site for <Dolicos>___ー <biflorus>___ー agglutinin in the small intestine of the mouse." J.Biochem.109. 178-183 (1991)
• [Publications] A.Oshima,K.Ito,Y.Nagao,H.Sakuraba and A.Suzuki: "βーGalactosidaseーdeficient human fibroblasts:Uptake and processing of the exogenous precursor enzyme expressed by stable transformant COS cells." Hum.Genet.85. 505-508 (1990)
• [Publications] T.Yamauchi,M.Hiraiwa,H.Kobayashi,Y.Uda,T.Miyatake and S.Tsuji: "Molecular cloning of two species of cDNAs for humanーNーacetylgalactosaminidase and expression in mammalian cells." Biochem.Biophs.Res.Commun.170. 231-237 (1990)