| Project/Area Number |
02262103
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| Research Category |
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
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| Allocation Type | Single-year Grants |
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| Research Institution | Nagasaki University |
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Principal Investigator |
新川 詔夫 長崎大学, 医学部, 教授 (00111170)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
孫田 信一 愛知県心身障害者コロニー発達障害研究所, 遺伝学部, 主任研究員 (00100165)
陣野 吉廣 長崎大学, 医学部, 助手 (20179097)
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| Project Period (FY) |
1990
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| Project Status |
Completed (Fiscal Year 1990)
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| Budget Amount *help |
¥9,000,000 (Direct Cost: ¥9,000,000)
Fiscal Year 1990: ¥9,000,000 (Direct Cost: ¥9,000,000)
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| Keywords | 染色体ミクロ切断 / がん抑制遺伝子 / 外骨腫遺伝子 / 遺伝子クロ-ニング / in situ hybridization |
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| Research Abstract |
<1.染色体顕微鏡切断・微量DNAクロ-ニング法の改良>___ー:(1)染色体標本作製時における短時間細胞固定および迅速分染、(2)切断片の乾燥状態での集積と微量(1nl)のproteinase K溶液・phenol/chloroformを用いたDNA抽出法の導入、(3)制限酵素NlaIIIに代わるSau3AIの採用による染色体DNAの消化、(4)染色体Sau3AI断片5'端に相補的な10mer linkerとそれに相補的な20mer primerの導入によるPCR、(5)psoralenー紫外線照射法の開発による汚染DNA混入防止、などの新しい手法の導入あるいは開発により、(1)では従来の染色体作製方法において生ずる染色体DNAの脱プリンやnickingを最小限に抑えること、(2)ー(5)ではクロ-ン取得効率の増大、PCR前及びその最中に生ずる汚染あるいは由来不明DNA混入を減少させることが可能になった。
<2.クロ-ンが8番染色体由来であることの検証>___ー:46個のクロ-ンをランダムに選択しプロ-ブとして、サザン法によりヒト全ゲノムDNA、ヒト8番染色体のみを含むヒト・マウス雑種細胞、およびマウス細胞とのhybridizationシグナルを調べた。46個中9個のクロ-ンでシグナルを検出した。うち6個はsingleーcopy DNAで、残りはrepetitive DNAであった。8q23ーq24のdissectionで得たPCR産物(2ug)をbiotinated duTPでラベルし、100ー500倍量のヒト全ゲノムDNAとの競合hybridizationの後、染色体上でfluorescence in situ hybridizationを行い、avidinーFITCと結合させた。8q23ーq24部位にFITCスポットを検出した。即ち、これらのクロ-ンは外骨腫遺伝子断片を含んでいる可能性が高い。
<3.陽性クロ-ンを用いたヒトゲノムDNAライブラリ-のスクリ-ニング>___ー:上記の陽性クロ-ンをプロ-ブにして、プラ-クhybridizationを行った。10万個のプラ-ク中陽性シグナルを2個に認めた。現在、このクロ-ンを用いてTRPS患者DNAを解析中である。
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