| Project/Area Number |
02263211
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| Research Category |
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
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| Allocation Type | Single-year Grants |
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| Research Institution | Keio University |
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Principal Investigator |
深沢 俊夫 慶應義塾大学, 医学部, 教授 (90029934)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
平岡 芳樹 慶応義塾大学, 医学部, 助手 (80218768)
西沢 正文 慶応義塾大学, 医学部, 助手 (20218150)
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| Project Period (FY) |
1990
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| Project Status |
Completed (Fiscal Year 1990)
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| Budget Amount *help |
¥2,500,000 (Direct Cost: ¥2,500,000)
Fiscal Year 1990: ¥2,500,000 (Direct Cost: ¥2,500,000)
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| Keywords | サッカロミセス酵母 / ガラクト-ス / 転写制御 / 蛋白ー蛋白相互作用 / 誘導物質 / 分子遺伝学 |
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| Research Abstract |
A:研究目的 酵母におけるガラクリ-ス代謝系酵素の構造遺伝子群<GAL1.7.10>___ーの転写は、<GAL4>___ーと呼ばれる遺伝子によってコ-ドされる蛋白が各遺伝子の上流にある17塩基対の共通配列(UAS)に結合することによって促進される。ガラクト-スの存在しないときには、<GAL80>___ーと呼ばれる遺伝子のコ-ドする蛋白に結合することによってその転写促進機能を抑える。本研究では、Gal80蛋白に関する上記の仮説を検証する。
B:研究成果 1)Gal80蛋白の精製法の改良と一次構造の解析;Gal80を、酵母内で<ENO1>___ー(エノラ-ゼの構造遺伝子)のプロモ-タ-を利用した高発現ベクタ-を用いて生産し、すでに得られている抗体を用いるウエスタンブロット法により検出しながら精製してきたが、時として精製標品のなかにアミノ末端一部を欠いた蛋白が混在していた。そこで、各種プロテア-ゼ阻害剤を用いてこの問題を解決することが出来た。すなわち、ロイペプチン、フェニルメチルスルフォニルフルオライド、ペプスタチン、アンチパインの混合物を加えることにより完全な蛋白の回収率を上げることが出来た。その結果、湿重量50グラムの菌体より、約2.3ミリグラムの、純度80%以上の精製標品を得ることが出来た。
2)精製されたGal80蛋白のゲル漉過法およびSDSゲル電気泳動法による相対分子量の測定結果から、本蛋白が生理的状態では単量体で存在することが判明した。また、そのアミノ末端がアセチル基でブロックされていることが明らかにされた。
3)Gal80とGal4との相互作用;ゲルシフト法によって、Gal4/UAS複合体と上記の精製Gal80との結合を検討したところ明確なGal80/Gal4/UAS複合体が観察された。この複合体にガラクト-スまたはその代謝経路上の誘導体を加えても乖離は見られなかった。
C:今後の展望 このようにしてGal80蛋白の大量精製の方法が確立したので今後、誘導物質ならびGal4との相互作用を物理化学的に解析していきたい。
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