遺伝子工学手法を応用した活性汚泥馴養機構の解明に関する研究

Research Project

Project/Area Number	02650380
Research Category	Grant-in-Aid for General Scientific Research (C)
Allocation Type	Single-year Grants
Research Field	都市工学・衛生工学
Research Institution	Osaka University
Principal Investigator	藤田正憲大阪大学, 工学部, 教授 (70029289)
Co-Investigator(Kenkyū-buntansha)	岩堀恵祐大阪大学, 工学部, 助手 (40183199) 古川憲治大阪大学, 工学部, 助教授 (60029296)
Project Period (FY)	1990
Project Status	Completed (Fiscal Year 1990)
Budget Amount *help	¥2,400,000 (Direct Cost: ¥2,400,000) Fiscal Year 1990: ¥2,400,000 (Direct Cost: ¥2,400,000)
Keywords	PVA酸化酵素 / PVA加水分解酵素 / 活性汚泥馴養 / コロニ-ハイブリダイゼイション
Research Abstract	1.活性汚泥のポリビニルアルコ-ル(PVA)による馴養過程の遺伝学的解明に必要な遺伝子断片を得るために研究室保有のPVA分解菌Pseudomonas vesicularis var.povalolyticus PH株の染色体からPVA分解酵素(酸化酵素および加水分解酵素)をコ-ドする遺伝子のクロ-ニングを試みた。ベクタ-pUC19と宿主E.coli JM103を用いたショットガン法で、合計約24,000の形質転換株をスクリ-ニングしたが,目的株は検出できなかった。 2.そこがPVA分解酵素を精製し、そのアミノ酸配列に応じて作成されたDNAプロ-ブを利用するクロ-ニングを試みた。両酵素はPH株の培養上澄液から、硫安分画、およびQーSEPHAROSE,TOYOPEARL HW50,BLUEーTOYOPEARL 650MLの各カラムクロマトグラフィ-により、電気泳動的に単一になるまで精製された。PVA酸化酵素は分子量約88,000、PVA加水分解酵素は分子量約68,000で、それぞれアミノ酸組成および一部のアミノ酸配列が決定された。これを基にDNAプロ-ブを作成し、PCR法を活用した遺伝子増幅法により、PH株染色体からのクロ-ニングを行っているが、現時点で両構造遺伝子は分離できていない。 3.一方、DNAコロニ-ハイブリダイゼイション法による活性汚泥中での特定遺伝子保有細菌の検出方法を、研究室で既に単離した遺伝子断片(サリチル酸酸化酵素およびカテコ-ル酸化酵素)のプロ-ブによって検討した。目的遺伝子保有菌は、ニトロセルロ-スフィルタ-上に極僅かでも(細胞数が10^5〜10^6個)ブロッティングされれば、活性汚泥細菌のバックグランドに対して十分容易に検出できることがわかった。 4.今後はPVA分解遺伝子のクロ-ニングを完了し、PVA馴養過程における細菌相および遺伝子相の変化を追跡する予定である。