好中球の細胞膜表面上の遊走および活性酸素産生担当分子の遺伝子学的解析

• Project/Area Number: 02670288
• Research Category: Grant-in-Aid for General Scientific Research (C)
• Allocation Type: Single-year Grants
• Research Field: 内科学一般
• Research Institution: Teikyo University
• Principal Investigator: 竹内 明輝 帝京大学, 医学部, 助教授 (70114535)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 橋本 喬史 帝京大学, 経済学部, 教授 (30082142)
• Project Period (FY): 1990
• Project Status: Completed (Fiscal Year 1990)
• Budget Amount: ¥2,100,000 (Direct Cost: ¥2,100,000); Fiscal Year 1990: ¥2,100,000 (Direct Cost: ¥2,100,000)
• Keywords: 好中球 / 遊走能 / 活性酸素産生能 / DNAクロ-ニング / 遺伝子解析 / 不平衡pH電気泳動 / 細胞膜表面蛋白質

Research Abstract

マウス腹腔内に、ヒト顆粒球を注入した後、脾細胞を取り出し、腫瘍細胞と反応させ融合細胞を作製した。次いで、蛍光抗体法を用いて顆粒球に特異的な抗体を産生する細胞を選び出し、大量のモノクロ-ナルな抗ヒト顆粒球抗体を得た。その中から顆粒球の遊走能または、活性酸素産生能を抑制するモノクロ-ナル抗体(mAb)TM316、及びTM2を得た。TM316は顆粒球機能において遊走能のみを特異的に抑制する抗体で、3種類の遊走因子に対する遊走能を抗体濃度依存性に抑制し、各遊走因子に対する抑制において、同程度の抑制率を示した。しかし、TM316は顆粒球の自動能は抑制しなかった。このことからTM316は遊走能に関連する膜表面抗原を認識する抗体であることが示唆された。一方、TM2と名付けた抗体は、顆粒球の遊走能抑制に加え、活性酸素産生能を抑制した。これらの抗体と反応する膜表面抗原の精製は、不平衡pH勾配電気泳動(nonーequilibrium pH gradient electrophoresis. NEPHGE)法を用いた、2次元電気泳動や、CNBrーactivated sepharose 4BにmAbをコ-トしこれに、ヒト顆粒球膜成分を反応させることにより行った。得られた精製蛋白(TM316対応抗原)をウサギに繰り返し免疫し、ポリクロ-ナル抗体を得た。フロ-サイトメトリ-解析の結果このポリクロ-ナル抗体は、顆粒球と反応し、さらに、ヒト顆粒球の3種類の遊走因子に対する遊走能を抑制した。また顆粒球膜蛋白をニトロセルロ-ス膜に転写し、ウサギ抗血清をプロ-プとしたWestern Blottingにおいて、mAbTM316と同じ分子量の場所に発色を認めた。現在は、この抗原分子の超微量アミノ酸配列解析機によりアミノ酸配列を決定中である。一方、顆粒球のcDNAライブラリ-より、TM316と反応する抗原を規定している遺伝子のクロ-ニングをモノクロ-ナル抗体およびポリクロ-ナル抗体をプロ-プにして行った。その結果目的の遺伝子を有するクロ-ンを多数得た。現在各クロ-ンについて解析中である。またTM2対応抗原については現在精製中である。