ヒトピルビン酸キナ-ゼcDNAを用いた遺伝子治療法の基礎的研究

Research Project

Project/Area Number	02671121
Research Category	Grant-in-Aid for General Scientific Research (C)
Allocation Type	Single-year Grants
Research Field	Hematology
Research Institution	The University of Tokyo
Principal Investigator	谷憲三朗東京大学, 医科学研究所, 講師 (00183864)
Co-Investigator(Kenkyū-buntansha)	小倉浩美東京大学, 医科学研究所, 教務職員 (90211135) 小澤敬也東京大学, 医科学研究所, 助教授 (30137707) 浅野茂隆東京大学, 医科学研究所, 教授 (50134614)
Project Period (FY)	1990
Project Status	Completed (Fiscal Year 1990)
Budget Amount *help	¥2,100,000 (Direct Cost: ¥2,100,000) Fiscal Year 1990: ¥2,100,000 (Direct Cost: ¥2,100,000)
Keywords	ヒトL型ピルビン酸キナ-ゼ / 遺伝子治療 / レトロウィルスベクタ- / 骨髄移植 / ヘルパ-細胞
Research Abstract	遺伝性溶血貧血の遺伝子治療法の確立を目的として,先ずヒトもしくはマウス血液細胞中への、ヒトL型ピルビン酸キナ-ゼ(PK)cDNAの導入をはかった。すなわち,レトロウィルスベクタ-(pMNSM)DNAにヒトL型PK cDNAを挿入し,LPKレトロウィルスプラスミドpMNーPKLを作製した。次にpMNSMーPKL DNAもしくはpMNSM DNAを各々別に,パッケ-ジング細胞株GP+env Amー12中にリン酸カルシウム法にて導入させた。細胞株はamphotropic細胞株であるが,この細胞株より得られたウィルス液の力価は1×10^4/ml低値であった。そこで、GP+86というecotropic細胞株に各DNAを導入し、それぞれのDNAに対応するecotropic細胞株とamphotropic細胞株を共培養することで,約1×10^6/mlと高力価のウィルス産生細胞株(ヘルパ-細胞)を得ることができた。このヘルパ-細胞染色体には明らかにpMNSMーPKL DNAが組み込まれていた。しかも、ヒトL型PKがmRNAレベルならびに蛋白質のレベルで発現していることが確認できた。次にこのヘルパ-細胞培養上清とNIH3T3細胞、FDCPー2(マウス白血病細胞株),HEL,KU812(ともにヒト白血病細胞株)の各細胞を共培養することで,これらの細胞をレトロウィルスで感染させた。被感染細胞染色体にはやはり,pMNSMーPKL DNAの組み込みがみとめられ、さらにヒトL型PK mRNAの発現がノザン法ならびにRTーPCR法で確認された。現在、マウス骨髄幹細胞(Lyn^ー,cーkit^ー)の濃縮をFACSにておこない,この細胞に上記と同様の方法でPMNSMーPKL DNAを導入し,マウスに骨髄移植を行い、生着した血球細胞中にヒトL型PK mRNAの発現をみとめるか否かを検討中である。この一連の研究結果は、PK異常に伴う遺伝性溶血性貧血の遺伝子治療法確立の為に大変重要な示唆を与えてくれるものである。