| Project/Area Number |
02807019
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| Research Category |
Grant-in-Aid for General Scientific Research (C)
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| Allocation Type | Single-year Grants |
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| Research Field |
General pharmacology
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| Research Institution | The University of Tokyo |
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Principal Investigator |
木村 康志 東京大学, 医学部, 助手 (30111511)
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| Project Period (FY) |
1990
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| Project Status |
Completed (Fiscal Year 1990)
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| Budget Amount *help |
¥1,800,000 (Direct Cost: ¥1,800,000)
Fiscal Year 1990: ¥1,800,000 (Direct Cost: ¥1,800,000)
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| Keywords | バゾプレッシンV_2受容体 / cDNAクロ-ニング / アフリカツメガエル卵母細胞 / LLCーPK1培養細胞 |
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| Research Abstract |
アセチルコリン受容体、アドレナリンβ受容体等の受容体についてcDNAクロ-ニング、一次構造の決定が行われているが、バゾプレッシンV_2受容体については受容体蛋白質精製の因難および高感度バイオアッセイの欠如等の問題があり未だ誰も成功していない。我々は腎臓由来でバゾプレッシンV_2受容体を持つLLCーPK1培養細胞3×10^8個からmRNA5.2mgを抽出精製し、さらにこれを蔗糖密度勾配超遠心分離法で分画した中から最も活性の高い分画41μgを鋳型として逆転写酵素でcDNAを合成し、これをラムダザップIIファ-ジベクタ-に組込み、in vitroパッケ-ジングで4.2×10^5プラ-クのラムダファ-ジcDNAライブラリ-を得た。このライブラリ-を30等分し、各群の1、4×10^4プラ-クからのファ-ジDNAを抽出精製する,このDNAからT_7RNAポリメラ-ゼでキャップ構造を持ちmRNA活性を有するRNAを転写合成し、これをアフリカツメガエル卵母細胞に注入し、バゾプレッシンV_2受容体を発現させた。高感度のV_2受容体バイオアッセイ法により陽性プラ-ク群と検出した。検出されたプラ-ク群をさらに10等分して増殖させ、ファ-ジDNAを抽出して同様の操作を繰返し、5回の操作でV_2受容体のcDNAクロ-ンに到達せんとしたが、カエル卵母細胞に内因性のV_2受容体様活性が冬期に入って出現してきたため未だ目的を果せないでいる。春から秋にかけての時期に再度クロ-ニングを試みる予定である。
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