| Project/Area Number |
03259201
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| Research Category |
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
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| Allocation Type | Single-year Grants |
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| Research Institution | Hokkaido University |
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Principal Investigator |
森岡 弘志 北海道大学, 薬学部, 助手 (20230097)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
紙谷 浩之 北海道大学, 薬学部, 教務職員 (10204629)
井上 英夫 北海道大学, 薬学部, 助教授 (80088856)
大塚 栄子 北海道大学, 薬学部, 教授 (80028836)
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| Project Period (FY) |
1991
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| Project Status |
Completed (Fiscal Year 1991)
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| Budget Amount *help |
¥2,000,000 (Direct Cost: ¥2,000,000)
Fiscal Year 1991: ¥2,000,000 (Direct Cost: ¥2,000,000)
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| Keywords | T4エンドヌクレア-ゼV / チミンダイマ- / フィルタ-バインディングアッセイ / 酵素ー基質複合体 / 2'ーフルオロチミジン |
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| Research Abstract |
チミンダイマ-誘導体(酵素反応の際に選択的に引き抜かれる5'側チミジンの糖部2'位の水素をフッ素に置換した基質)は以下のようにして得た。まず、2'位にフッ素原子を導入したチミジン(2'ーフルオロT)を合成し、5'ー水酸基を保護した後、3'ーホスホアミダイト体とした。2'ーフルオロTを含むドデカデオキシリボヌクレオチド(dGCACGT^*TGCACG、T^*:2'ーフルオロT)を固相法で合成した後、紫外線を照射してチミンダイマ-を形成させた。相補鎖d12mer(dCGTGCAACGTGC)とハイブリダイズさせて2本鎖とした後、T4エンドヌクレア-ゼVの基質として用いた。
フィルタ-バインディングアッセイにより酵素ー基質複合体の解離定数(Kd)を求めると、通常のチミンダイマ-を含む基質を用いた場合にはKd=1.6×10^<ー8>M、2'ーフルオロ体を含む基質誘導体ではKd=3.3×10^<ー8>Mとなり、酵素との結合に関してはほとんど同じであることがわかった。また、酵素の基質切断反応について調べると、2'ーフルオロ体を含む基質誘導体では全く切断がみられなかった。
以上の結果から、2'ーフルオロ体を含む基質誘導体は、T4エンドヌクレア-ゼVにより認識されるが、鎖の切断を受けない基質となりうることを見いだした。この基質誘導体は、これまでに得られていないT4エンドヌクレア-ゼVー基質複合体結晶のX線構造解析に応用できるものと考えられる。
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