強力なカフェイン感受性チャンネル開口薬MBEDを用いたCa遊離チャンネルの研究

Research Project

Project/Area Number	03268202
Research Category	Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
Allocation Type	Single-year Grants
Research Institution	Tohoku University
Principal Investigator	大泉康東北大学, 薬学部, 教授 (00006355)
Co-Investigator(Kenkyū-buntansha)	松岡節東北大学, 薬学部, 教務職員 (40238986) 古川賢一東北大学, 薬学部, 助手 (20165468)
Project Period (FY)	1991
Project Status	Completed (Fiscal Year 1991)
Budget Amount *help	¥1,800,000 (Direct Cost: ¥1,800,000) Fiscal Year 1991: ¥1,800,000 (Direct Cost: ¥1,800,000)
Keywords	カルシウム / チャンネル / カフェイン / 血管平滑筋 / トキシン / タンパク精製
Research Abstract	まず,ウシ大動脈平滑筋のミクロソ-ム画分の[ ^3H]MBED結合能について検討したところ,特異的な結合部位の存在が明らかとなり,その解離定数および最大結合量としてそれぞれ50nMおよび20pmol/mg‐proteinの値を得た.ついで,この[ ^3H]MBED結合蛋白質の精製を試みた.平滑筋ミクロソ-ムを可溶化し,MonoQカラムによる陰イオン交換クロマトに付したところ,塩濃度が0.2Mおよび0.4M付近に2つの特異的結合能のピ-クが溶出された.前半のピ-クには分子量〜130KDa,〜58KDaの2つの主要なバンドが認められ,一方,後半のピ-クには微弱な多数のバンドが存在した.そこで前半のピ-クを脱塩後,再度MonoQカラムクロマトに付した.塩濃度0.22Mの位置に〜130KDa,〜58KDaの2つのバンドが濃縮された.このピ-クをSuperose6カラムを用いてゲル濾過に付したところ,2つの主要なピ-クが得られ,それぞれ〜130KDa,〜58KDaのバンドに対応していた.このうち〜58KDaのピ-クを含む画分の特異的結合能が最も高かったため,この画分をMonoQカラムクロマトに付したところ,塩濃度が約0.21Mの位置に特異的結合能の鋭いピ-クが検出された.その中央の画分には〜58KDaの蛋白質がほぼ単一バンドとして認められ,MBEDの特異的結合能のピ-クと一致した.以上のようにウシ大動脈平滑筋ミクロソ-ムから〜58KDaの[ ^3H]MBED結合蛋白質が精製されたが,収率が低いという問題点が残された.その機能を調べるためには,収率の高い精製法を確立する必要があるため,現在,この58DKaに対する特異的抗体の調製を進めており,それを用いてアフィニティ-精製を試みる予定である.得られた蛋白質の分子量は,58KDaと,リアノジン結合蛋白質と比較してかなり小さい.今後,この蛋白質が,Ca遊離チャネルとしての機能を有するのかどうか検討する.