モルモットにおけるビタミンC合成不能の起因となる遺伝子の構造決定と遺伝子治療

Research Project

Project/Area Number	03454549
Research Category	Grant-in-Aid for General Scientific Research (B)
Allocation Type	Single-year Grants
Research Field	代謝生物化学
Research Institution	Institute of Applied Biochemistry
Principal Investigator	錦見盛光 (財)応用生化学研究所, 副所長兼部長 (20022816)
Co-Investigator(Kenkyū-buntansha)	林豊 (財)応用生化学研究所, 研究員 (70238137) 河合敏秀 (財)応用生化学研究所, 研究員 (50224720)
Project Period (FY)	1991 – 1992
Project Status	Completed (Fiscal Year 1992)
Budget Amount *help	¥3,700,000 (Direct Cost: ¥3,700,000) Fiscal Year 1992: ¥1,300,000 (Direct Cost: ¥1,300,000) Fiscal Year 1991: ¥2,400,000 (Direct Cost: ¥2,400,000)
Keywords	ビタミンC / アスコルビン酸 / モルモット / 遺伝子導入 / グロノラクトン酸化酵素 / リポソーム / トランスフェクション / 遺伝子発現 / 壊血病 / 遺伝子欠損 / 偽遺伝子 / 塩基配列
Research Abstract	モルモットがヒトと同様にアスコルビン酸(ビタミンC)を合成することができないのは、Lーグロノーγーラクトン酸化酵素(GLO)を欠損しているためである。本研究において、モルモット培養細胞および個体へのラットGLOミニ遺伝子の導入によるGLOの発現を試みた。ラットGLOのcDNAをSV40の初期プロモーターの下流に継いで、ベクターN_2(マウス白血病ウイルスのLTRの下流にTn5由来のネオマイシン耐性遺伝子を持つ)のXhoIサイトへ挿入した構築体を作製した。これをモルモット細胞104Clヘリポソーム法によってトランスフェクトし、200μg/mlのG418に対し耐性になった細胞を得た。その細胞の抽出液のGLO活性をHPLCを用いる活性測定法により調べたところ、0.1〜0.2nmol/min/mg proteinの活性が検出された。さらに、上記のGLOミニ遺伝子を導入した細胞の培養中のメジウムへGLOの基質であるLーグロノーγーラクトンを添加した場合はもとより、GLOより2段階前の前駆体であるDーグルクロン酸を供給するためDーグルクロノーγーラクトンを添加した場合にも、アスコルビン酸が生成することをHPLCを用いて確認した。しかし、培養しただけの細胞中にはアスコルビン酸を検出できなかった。次に、モルモット肝臓へGLOミニ遺伝子を導入することによりGLOを発現できるかどうかを調べた。哺乳動物細胞での発現ベクターpMSGへラットGLOのcDNAを組み込んだ構築体をプラスに荷電したリポソームへ封入し、DNA量で100μgを門脈より注入し、3日後にモルモットを屠殺し、肝臓を固定後、免疫組織化学的方法でGLOの染色を行ったところ、5個体のうち1個体で陽性な細胞が検出された。しかし、肝臓ミクロソームでGLO活性を検出できなかった。これは遺伝子が導入されて発現する細胞の割合が少ないことに基づくものと思われる。