| Project/Area Number |
03670498
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| Research Category |
Grant-in-Aid for General Scientific Research (C)
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| Allocation Type | Single-year Grants |
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| Research Field |
Pediatrics
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| Research Institution | Nagasaki University |
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Principal Investigator |
吉本 雅昭 長崎大学, 医学部, 講師 (70167021)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
松本 正 長崎大学, 医学部, 講師 (70190535)
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| Project Period (FY) |
1991
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| Project Status |
Completed (Fiscal Year 1991)
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| Budget Amount *help |
¥2,000,000 (Direct Cost: ¥2,000,000)
Fiscal Year 1991: ¥2,000,000 (Direct Cost: ¥2,000,000)
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| Keywords | 21ー水酸化酵素欠損症 / PCR / DGGE / SSCP / 家系診断 |
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| Research Abstract |
1)家系員のDNA抽出;集積した25家系の家系員の末梢白血球よりDNAを抽出し保存した。
2)プライマ-の作成;21ー水酸化酵素B遺伝子(21ーOHB)内に計12組、24種類のPCR用プライマ-を作成した。このうち6組は21ーOHBのみを増幅する組合せであり、かつ21ーOHBの全遺伝子領域を増幅可能な組合せである。
3)PCR法によるDNA増幅;(1)発端者の検索;25名の発端者において21ーOHB遺伝子の第3ー5エクソンを増幅するプライマ-を用いて増幅し(480塩基長DNA断片)、6名に遺伝子欠失パタ-ンを検出した。この6家系では次子の胎児診断は容易である。(2)家系員の検系;25家系の両親、同胞、19名の発端者から(1)と同じDNA領域を増幅して保存した。
4)DGGE法による解析;発端者が欠失パタ-ンを示さない5家系の家系員をDGGE法により点変異の有無を検討した。2家系で両親のいずれかが2個のalleleの泳動パタ-ンが異なり、連鎖解析が可能であった。しかし増幅DNA断片が480bpと比較的長いため、長時間の電気泳動を必要とする。両親のalleleが区別できなかった1家系に於て一方のプライマ-に30bpのGCを接続するGCーclumped DGGE法を施行し父でalleleの区別が可能であったが、やはり長時間の泳動を要した。
5)SSCP法による解析;より簡便な診断法を確立するためPCRーSSCP銀染色法を施行した。3)ー(1)の480bp断片は制限酵素PvuIIで切断すると360bpと120bpの平滑末端を有する2個の断片に分かれる。PCR産物をPvuII消化後SSCPー銀染色を行うことにより、4種のalleleを同時に検索可能であり、かつ4時間の電気泳動で十分であった。6家系の両親・発端者での検討では、両親の計4個のalleleのうち少なくとも1個のalleleは全家系で区別可能であった。この方法は非常に簡便であり、放射線被爆はなく、かつ効率の良い方法である。
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